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    不同鹽度下脊尾白蝦proPO 和SOD 基因表達(dá)及其酶活力分析

    2020-06-29 00:23:34許振山張偉麗梁俊平李吉濤
    河南水產(chǎn) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:脊尾白蝦凡納濱

    許振山, 張 靜, 張偉麗, 梁俊平,, 李 健, 李吉濤

    (1. 河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng)453007;2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島266071)

    脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)是一種小型經(jīng)濟(jì)蝦類,廣泛分布于中國(guó)沿海和朝鮮半島西岸的淺海水域,生長(zhǎng)速度快,適應(yīng)性廣[1-2],特別是對(duì)鹽度具有較強(qiáng)的適應(yīng)性,在河口及淺海區(qū)域均可正常生存,甚至通過(guò)逐漸淡化可在淡水中生存[3]。梁俊平等[4]研究發(fā)現(xiàn),脊尾白蝦在5-30鹽度下,可正常抱卵、孵化,但在不同鹽度下,子代生長(zhǎng)速度差異顯著,其最適生長(zhǎng)鹽度為20,在此鹽度下Na+-K+-ATPase mRNA表達(dá)量也最低,可能是在此鹽度下,滲透壓調(diào)節(jié)耗能較小,更多的能量用于了生長(zhǎng)。研究表明,鹽度不僅會(huì)影響甲殼動(dòng)物生長(zhǎng)、繁殖,而且會(huì)影響甲殼動(dòng)物免疫防御能力。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)從鹽度為25的水體中轉(zhuǎn)移到鹽度為5和15的水體中后,其酚氧化酶(phenofoxidase,PO)活力均有所下降,而轉(zhuǎn)移到35的水中,其PO活力顯著增加。葉建生等[6]研究也發(fā)現(xiàn),鹽度突變對(duì)凡納濱對(duì)蝦免疫酶活有顯著影響,當(dāng)從鹽度30突變到27、24、21等不同鹽度后,超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)酶活力顯著降低。王瑞芳等[7]對(duì)中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)急性鹽度脅迫后發(fā)現(xiàn),PO活力隨鹽度逐漸升高呈顯著下降趨勢(shì)。由此可見(jiàn),急性鹽度變化對(duì)甲殼動(dòng)物免疫力有重要影響。

    李玉全、李洋等[8-10]對(duì)脊尾白蝦急性鹽度脅迫后發(fā)現(xiàn),無(wú)論是高鹽度突降到低鹽度或是低鹽度驟升到高鹽度,都會(huì)對(duì)SOD、PO活力產(chǎn)生負(fù)面影響。那么,對(duì)于長(zhǎng)期生活在不同鹽度水體中脊尾白蝦,其生長(zhǎng)速度與其免疫力是否存在某種相關(guān)性?本研究選擇長(zhǎng)期生活在不同鹽度下的脊尾白蝦,比較了不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺proPO和SOD基因表達(dá)及其酶活力水平,以期為不同鹽度水域脊尾白蝦健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    性成熟脊尾白蝦親蝦經(jīng)逐漸淡化后,養(yǎng)殖于鹽度30、25、20、15、10、5水體中,在此6個(gè)鹽度下交尾抱卵,直至幼體孵化,并繼續(xù)培育。本實(shí)驗(yàn)選取不同鹽度下生長(zhǎng)的幼蝦,養(yǎng)殖于200 LPVC桶,水溫18℃,充氣。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 取樣及樣品處理

    每個(gè)鹽度設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)取5尾脊尾白蝦,迅速解剖取肝胰腺置入1.5 mL無(wú)RNA酶離心管,放入液氮冷凍。之后將肝胰腺放入研缽,加液氮研磨成粉末,一部分研磨樣品轉(zhuǎn)移至離心管,加入預(yù)冷PBS 緩沖溶液,漩渦震蕩,4℃800×g離心10 min,吸取上清液,置-80℃保存用于酶活力測(cè)定。取另一部分研磨樣品轉(zhuǎn)至1.5 mL無(wú)RNA酶離心管(內(nèi)含1.0 mL TRIzol液),漩渦震蕩,置-80℃保存用于總RNA提取。

    1.2.2 酶活力測(cè)定

    采用試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))測(cè)定SOD活性,采用改進(jìn)的Ashida方法和雷質(zhì)文等[12]方法測(cè)定PO活性。

    1.2.3 proPO基因和SOD基因表達(dá)分析

    采用Trizol法提取脊尾白蝦肝胰腺RNA,用MOPS瓊脂糖電泳檢測(cè)總RNA的完整性,按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。根據(jù)GenBank中脊尾白蝦proPO基因和SOD基因序列,分別設(shè)計(jì)熒光定量特異引物,內(nèi)參基因?yàn)閍ctin,所用引物如表1所示。利用熒光定量PCR對(duì)不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺proPO基因和SOD基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序按照SYBR Premix Ex TaqTM II(TaKaRa)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△CT法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

    1.3 統(tǒng)計(jì)分析

    各鹽度下酶活力和基因表達(dá)量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示,采用SPSS16.0軟件中單因子方差分析(one-way-ANOVA)檢驗(yàn)顯著性差異(P<0.05)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺proPO基因表達(dá)量和PO活力變化

    如圖1所示,隨著鹽度升高,脊尾白蝦肝胰腺proPO基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì),鹽度15和20兩組間的proPO基因表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P>0.05),但顯著高于其它鹽度組的表達(dá)量(P<0.05)。脊尾白蝦肝胰腺PO活力也呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì),鹽度15 和20 兩組間的酶活力無(wú)顯著性差異(P>0.05),但顯著高于其它鹽度組的酶活力(P<0.05)(圖2)。

    圖1 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺proPO基因表達(dá)量變化Fig.1 Effect of salinity on proPO mRNA levels of E. carinicauda

    圖2 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺PO活力Fig.2 Effect of salinity on PO activities of E. carinicauda

    2.2 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺SOD基因表達(dá)量和SOD活力變化

    如圖3所示,隨著鹽度升高,脊尾白蝦肝胰腺SOD基因表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì),鹽度15和20時(shí)的SOD基因表達(dá)量顯著高于其它鹽度組基因表達(dá)量(P<0.05);肝胰腺SOD活力變化趨勢(shì)與其基因表達(dá)趨勢(shì)相同(圖4)。

    圖3 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺SOD基因表達(dá)量變化Fig.3 Effect of salinity on SOD mRNA levels of E. carinicauda

    圖4 不同鹽度下脊尾白蝦肝胰腺中SOD活力Fig.4 Effect of salinity on SOD activities of E. carinicauda

    3 討論

    3.1 不同鹽度下脊尾白蝦proPO基因表達(dá)量及PO活力變化

    酚氧化酶(phenofoxidase,PO)在甲殼動(dòng)物的非特性免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要識(shí)別和防御作用[13]。一般情況下,PO以無(wú)活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase,proPO)形式存在,β-1,3-葡聚糖(β-1,3-G)、脂多糖、胰蛋白、加熱、Ca2+濃度下降等都可以激活proPO系統(tǒng),引發(fā)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng),生成有活性的PO[8],對(duì)病原體起到抑制作用或殺死病原體,從而可降低微生物對(duì)宿主的感染幾率[8-14]。本研究顯示,長(zhǎng)期生活在不同鹽度水體中的脊尾白蝦,PO活力隨著鹽度升高均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì),在鹽度15和20時(shí)的酶活力顯著高于其它鹽度組,同時(shí)proPO基因mRNA表達(dá)量也呈現(xiàn)相似趨勢(shì)。前期研究發(fā)現(xiàn),脊尾白蝦在鹽度17.5左右表現(xiàn)出最快生長(zhǎng)速度[4],與PO活力變化趨勢(shì)基本一致。這說(shuō)明在此鹽度下,脊尾白蝦proPO系統(tǒng)可被有效激活,以提高自身免疫力應(yīng)對(duì)環(huán)境變化。

    當(dāng)凡納濱對(duì)蝦從鹽度為25的水體中轉(zhuǎn)移到鹽度為5和15的水體中后,其PO活力均有所下降,而轉(zhuǎn)移到35的水中,其PO活力有所增加[5],說(shuō)明不適鹽度降低了凡納濱對(duì)蝦的免疫力。在中華絨螯蟹研究中也發(fā)現(xiàn),與淡水組相比,隨著鹽度逐漸升高,中華絨螯蟹雄蟹PO活力呈顯著下降趨勢(shì)[15]。而當(dāng)凡納濱對(duì)蝦仔蝦養(yǎng)殖在鹽度2.5、5、15、25、35水體中24周后,鹽度15、25、35時(shí)PO活力顯著高于鹽度為2.5和5 的活力;通過(guò)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和WSSV感染后發(fā)現(xiàn),鹽度15、25、35時(shí)的死亡率顯著低于鹽度為2.5和5的死亡率,研究認(rèn)為凡納濱對(duì)蝦在低鹽度下抗病力降低與體內(nèi)PO活力降低有關(guān)[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致,說(shuō)明PO酶活力可作為評(píng)價(jià)脊尾白蝦不同鹽度下免疫力強(qiáng)弱的指標(biāo)。李洋等[8]研究顯示,不同鹽度急性脅迫后,低鹽度下脊尾白蝦proPO基因表達(dá)量在短時(shí)間內(nèi)顯著高于高鹽度組,而當(dāng)脅迫48 h后,各鹽度下proPO基因表達(dá)量趨于穩(wěn)定且無(wú)顯著性差異,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有相似之處,但也有一定差別。可能是由于不同實(shí)驗(yàn)所選實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生活環(huán)境不同所導(dǎo)致,李洋等[8]所選的脊尾白蝦為生活在鹽度32的成蝦,對(duì)鹽度適應(yīng)性較強(qiáng),短時(shí)間內(nèi)對(duì)鹽度變化導(dǎo)致免疫酶活變化顯著,而后適應(yīng)了各鹽度條件。而本實(shí)驗(yàn)所選脊尾白蝦幼蝦為在各鹽度下孵化而來(lái),從幼體階段一直生活在其各自鹽度環(huán)境條件下,其免疫酶活是各鹽度下長(zhǎng)期適應(yīng)下的反映。

    3.2 不同鹽度下脊尾白蝦SOD基因表達(dá)量及其酶活力變化

    SOD是機(jī)體內(nèi)重要的的抗氧化酶之一,可以阻斷因自由基造成的細(xì)胞損傷,并及時(shí)修復(fù)損傷細(xì)胞,在抗氧化方面發(fā)揮重要的生理作用[17]。在凡納濱對(duì)蝦成蝦中研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)鹽度從30突變到27、24、21等低鹽度后,鹽度突變組SOD活性顯著低于對(duì)照組[6]。當(dāng)鹽度從12驟降到8或5時(shí),凡納濱對(duì)蝦仔蝦SOD活性也顯著降低[18]。李玉全等[10]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)鹽度從33降低到5或升高至45 時(shí),都會(huì)對(duì)脊尾白蝦SOD活力產(chǎn)生負(fù)面影響,而對(duì)照組鹽度33時(shí)的SOD 活力維持在最高水平。由此可見(jiàn),當(dāng)甲殼動(dòng)物處于最佳生活環(huán)境下,其免疫力也最強(qiáng),而環(huán)境突變可能會(huì)顯著影響其免疫力。本研究顯示,長(zhǎng)期生活在不同鹽度水體中的脊尾白蝦,SOD活力隨著鹽度升高均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì),在鹽度15和20時(shí)的酶活力顯著高于其它鹽度組,SOD基因mRNA表達(dá)量也呈現(xiàn)相似趨勢(shì)。梁俊平等[4]研究發(fā)現(xiàn),脊尾白蝦在鹽度17.5左右表現(xiàn)出最快生長(zhǎng)速度;姜巨峰等[19]也發(fā)現(xiàn),脊尾白蝦在鹽度15、20時(shí)的特定生長(zhǎng)率顯著高于其它鹽度組。說(shuō)明脊尾白蝦在鹽度15-20時(shí)表現(xiàn)出最快生長(zhǎng)速度與其具有較強(qiáng)免疫力密切相關(guān)。

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