基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討六合丹治療急性胰腺炎的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制

王銳 韓晨霞 彭?xiàng)?王怡欽 夏慶 杜丹

1四川大學(xué)華西醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，成都 610041；2四川大學(xué)華西醫(yī)院華西-華盛頓線粒體與代謝研究中心，成都 610041

中醫(yī)藥對AP的臨床治療作用在國內(nèi)已經(jīng)獲得廣泛認(rèn)可。四川大學(xué)華西醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科自上世紀(jì)90年代確立了“益活清下”法，使用內(nèi)服、外敷或灌腸等給藥途徑治療AP，明顯改善了AP患者的胃腸動(dòng)力，減緩病情發(fā)展并縮短住院病程[1-2]。六合丹作為傳統(tǒng)外敷劑具有清熱解毒、消腫止痛和散結(jié)化瘀等功效[3-4]。采用六合丹外敷可以快速減輕AP患者腹部和腰肋部腫脹疼痛、促進(jìn)積液吸收、減少后期囊腫等并發(fā)癥發(fā)生以及縮短患者再進(jìn)食時(shí)間[2,5-7]。目前對于六合丹治療AP的研究[7-10]多從臨床表征、入血成分或單一靶點(diǎn)為切入點(diǎn)展開，無法系統(tǒng)地闡釋六合丹有效成分及作用機(jī)制。隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的提出，多成分、多靶點(diǎn)及系統(tǒng)調(diào)控的研究思路有利于推進(jìn)中醫(yī)藥的深入研究及臨床應(yīng)用[11-13]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法闡述六合丹治療AP的活性化學(xué)成分、靶點(diǎn)及相關(guān)通路。

資料與方法

一、六合丹活性化學(xué)成分及靶點(diǎn)

通過中醫(yī)百科全書數(shù)據(jù)庫(The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM)[14]檢索六合丹的6味中藥材(大黃、黃柏、白芷、白術(shù)、薄荷和烏梅)，獲得六合丹所有的化學(xué)成分，并通過數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)預(yù)測功能，獲得六合丹的活性化學(xué)成分，根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)相似度評分Tanimoto>0.8，預(yù)測相關(guān)靶點(diǎn)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫對獲得的靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，物種限定為“Homo sapiens”，得到官方名稱。

二、AP相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過在人類疾病信息相關(guān)數(shù)據(jù)庫[OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man)、DisGeNET、HPO(The Human Phenotype Ontology)、NCBI(National Center for Biotechnology Information)]中以“acute pancreatitis”作為檢索詞對AP相關(guān)基因進(jìn)行檢索、篩查并整合，獲得AP相關(guān)的候選靶點(diǎn)。利用UniProt數(shù)據(jù)庫對候選靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，物種限定為“Homo sapiens”，得到官方名稱。

三、六合丹治療AP的活性化學(xué)成分及靶點(diǎn)

將六合丹化學(xué)成分對應(yīng)的靶點(diǎn)與AP的候選靶點(diǎn)取交集，重合靶點(diǎn)即為六合丹活性成分作用于AP的靶點(diǎn)，同時(shí)可以得到每個(gè)靶點(diǎn)對應(yīng)的活性化學(xué)成分。

四、靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

利用STRING(Search Tool for Retrieval of Interacting Proteias)數(shù)據(jù)庫[15]對靶點(diǎn)蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系進(jìn)行分析。將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入SRTING數(shù)據(jù)庫，物種限定為“Homo sapiens”，每對蛋白之間相互作用可信度設(shè)置為>0.7，將以上限定作為篩選條件得到靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)信息導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，利用網(wǎng)絡(luò)分析功能分析網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩?，并根?jù)節(jié)點(diǎn)度值、中介中心性兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)篩選PPI的核心靶點(diǎn)。

五、功能富集分析

將六合丹治療AP的作用靶點(diǎn)上傳至CPDB網(wǎng)站[16]及STRING網(wǎng)站，物種限定為“Homo sapiens”，分別進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。以P<0.01、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到靶點(diǎn)富集的GO和KEGG通路信息。

六、構(gòu)建六合丹治療AP的“中藥材-活性化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

將上述中藥材、對應(yīng)活性化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)及通路信息導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，分別用不同顏色及形狀的節(jié)點(diǎn)(node)表示中藥材、活性化合物、靶點(diǎn)及通路，并用“邊”來連接中藥材、活性化學(xué)成分、靶點(diǎn)及其對應(yīng)通路。同時(shí)利用網(wǎng)絡(luò)分析功能分析網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩?，并根?jù)節(jié)點(diǎn)度值、中介中心性兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)篩選六合丹治療AP的網(wǎng)絡(luò)中重要活性化學(xué)成分及靶點(diǎn)。

結(jié) 果

一、六合丹化合物及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫

六合丹6味藥材共找到213種化合物， 其中大黃88種、黃柏24種、白術(shù)21種、白芷54種、薄荷27種及烏梅4種化合物。將六合丹中含有靶點(diǎn)(Tanimoto評分>0.8)的化合物定義為活性化學(xué)成分，顯示大黃、黃柏、白術(shù)、白芷、薄荷、烏梅分別含有76、12、12、19、7、3種活性化學(xué)成分，分別對應(yīng)147、113、114、279、48、62個(gè)相應(yīng)靶點(diǎn)。刪除重復(fù)值后，共獲得128種活性化學(xué)成分，對應(yīng)505個(gè)靶點(diǎn)。

二、AP相關(guān)靶點(diǎn)

通過OMIM、DisGeNet、HPO和NCBI數(shù)據(jù)庫檢索，分別獲得AP相關(guān)靶點(diǎn)10、268、52和294個(gè)。刪除重復(fù)值后，共獲得530個(gè)靶點(diǎn)。

三、六合丹治療AP的活性化學(xué)成分和靶點(diǎn)

通過分析整合六合丹的128種活性化學(xué)成分、對應(yīng)的505個(gè)靶點(diǎn)和530個(gè)AP相關(guān)靶點(diǎn)，最終得到六合丹治療AP的活性化學(xué)成分共111種(表1、2)，作用靶點(diǎn)共39個(gè)(表3)。大黃、黃柏、白術(shù)、白芷、薄荷、烏梅分別含有72、11、9、13、4和3種活性化學(xué)成分，分別可調(diào)控19、7、6、25、5和5個(gè)AP靶點(diǎn)。

表1 大黃治療急性胰腺炎的活性化學(xué)成分

表2 黃柏、白術(shù)、白芷、薄荷、烏梅治療急性胰腺炎的活性化學(xué)成分

表3 六合丹治療急性胰腺炎活性成分的靶點(diǎn)

四、39個(gè)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了六合丹治療AP的39個(gè)作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)其中26個(gè)靶點(diǎn)具有相互作用關(guān)系(圖1)。根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值、中介中心性兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)顯示，INS、FABP1、TLR4、PTGS2和CYP2E1是PPI網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)。

圖1 六合丹治療急性胰腺炎的PPI網(wǎng)絡(luò)

五、39個(gè)靶點(diǎn)的富集功能分析

對39個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析，根據(jù)P<0.01共獲得650條富集信息，其中生物學(xué)過程575條，分子功能49條，細(xì)胞組成26條。生物學(xué)過程前20條，細(xì)胞組成和分子功能的前10條富集信息見圖2。

對39個(gè)共同靶點(diǎn)行KEGG通路富集分析，獲得46條信息。根據(jù)FDR校正后的P值排序，前10位的KEGG通路見表4，涉及到與AP發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)的胰腺分泌、膽汁分泌、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators activated receptors, PPAR)信號通路、脂肪的消化吸收、花生四烯酸代謝及鈣信號通路等。

圖2 六合丹治療急性胰腺炎靶點(diǎn)的GO功能富集圖

表4 六合丹治療急性胰腺炎的靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

注：KEGG為京都基因與基因組百科全書；PPAR為過氧化物酶體增殖物激活受體

六、六合丹治療AP的“中藥材-活性化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

根據(jù)以上結(jié)果，通過Cytoscape軟件繪制六合丹治療AP的網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小，重點(diǎn)突出關(guān)鍵靶點(diǎn)及主要活性化合物(圖3)。網(wǎng)絡(luò)圖中共包括166個(gè)節(jié)點(diǎn)和480條邊。節(jié)點(diǎn)度值和中介中心度兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)顯示，procyanidin b2 3,3′-di-O-gallate、procyanidin b1 3′O-gallate、kaempferol、tridecanoic acid、cetylic acid和13-methyl pentadecanoic acid 等活性化合物及ALDH2、ALB、ABCB1、CYP1A1和PTGS2等作用靶點(diǎn)在六合丹治療AP的網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用。

注：紅色方塊表示中藥材，綠色菱形表示對應(yīng)的111種活性化學(xué)成分，藍(lán)色v型圖標(biāo)表示39個(gè)靶點(diǎn)；粉色三角形表示KEGG富集排名前10的通路；“邊”表示中藥材、活性化合物、靶點(diǎn)及通路之間的關(guān)系

圖3 六合丹治療急性胰腺炎的“中藥材-活性化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

討 論

AP屬于中醫(yī)“腹痛”、“脾心痛”、“胰癉”范疇，病機(jī)主要是肝脾氣機(jī)郁滯導(dǎo)致濕、熱、瘀蘊(yùn)結(jié)中焦；中醫(yī)治療原則主要以疏肝理脾、清熱利濕、恢復(fù)胃腸通降之特性[17-18]。近年應(yīng)用中藥復(fù)方治療AP的療效得到肯定，中藥的治療作用具有多環(huán)節(jié)多靶點(diǎn)的效應(yīng)，可以調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力、腸道屏障功能、細(xì)胞因子和炎癥遞質(zhì)、微循環(huán)、胰酶活性等多個(gè)方面[10,19-27]。六合丹作為傳統(tǒng)中藥外敷治療AP已有20余年，臨床療效顯著。實(shí)驗(yàn)也證明六合丹外敷可以改善AP大鼠微循環(huán)障礙、減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、降低血淀粉酶水平[8-10,28]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，第一次構(gòu)建了六合丹治療AP的“中藥材-活性化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)性地闡釋了六合丹治療AP的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制。本結(jié)果顯示，六合丹治療AP的活性化學(xué)成分有111種，包括蒽醌、黃酮、香豆素、生物堿和脂肪酸等幾類化學(xué)成分；可以通過39個(gè)治療靶點(diǎn)(ALDH2、ALB、ABCB1、CYP1A1和PTGS2等)影響藥物代謝、炎癥調(diào)節(jié)和氧化還原等多個(gè)生物學(xué)過程以及胰腺分泌、膽汁分泌和PPAR信號通路等多條通路，達(dá)到治療AP的效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，六合丹中大部分活性化學(xué)成分作用于2個(gè)及以上靶點(diǎn)，其中大黃所含活性成分最多，與本課題組前期對大承氣湯的研究結(jié)果類似[29]，其所含蒽醌類化學(xué)成分具有抗菌、抗炎、瀉下、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡等藥理作用[30-33]。此外其他幾味中藥所含化學(xué)成分也具有多種藥理活性：黃柏中β-sitosterol具有良好的抗病毒、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等活性[34]；白術(shù)中atractylenolide Ⅲ具有保護(hù)胃腸功能、抗炎、抗腫瘤等作用[35-38]；烏梅中的naringenin屬于黃酮類，具有雌激素樣作用、調(diào)節(jié)能量代謝、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等效果[39]。本研究結(jié)果顯示，與活性成分關(guān)聯(lián)較多的靶點(diǎn)有ABCB1、ALB、CYP1A1、 ALDH2和PTGS2，可見單個(gè)成分可以作用于多個(gè)靶點(diǎn)，且一個(gè)靶點(diǎn)也可以同時(shí)與多個(gè)成分相關(guān)聯(lián)，說明六合丹治療AP具有多成分和多靶點(diǎn)的特性。

通過對靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，INS、FABP1、TLR4、PTGS2和CYP2E1為LHD治療AP的主要作用靶點(diǎn)。AP患者由于胰腺組織受損而內(nèi)外分泌功能紊亂，影響胰島素的分泌與排泄，易引起血糖升高，而血糖水平與患者病情嚴(yán)重程度有關(guān)[40-41]；AP發(fā)病時(shí)的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)及微血管滲漏會(huì)引起腸道缺血、缺氧造成黏膜上皮損傷[42]；FABP1和脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝調(diào)節(jié)及器官組織損傷有關(guān)，血清FABP1水平在AP患者中明顯升高，且與患者病情程度、預(yù)后以及并發(fā)癥的發(fā)展有關(guān)[43-44]；TLR4是Toll樣受體家族的成員之一，可以通過活化NF-κB引起多種促炎細(xì)胞因子的激活，引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征[45]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明胰腺組織中存在TLR4表達(dá)，抑制或者下調(diào)TLR4能夠治療AP[46-48]。PLGS2也稱為環(huán)氧化酶2，通常的炎癥微環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)其表達(dá)，是花生四烯酸代謝的關(guān)鍵酶[49]。

GO富集分析顯示39個(gè)靶點(diǎn)分布于胞外區(qū)、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞核中，參與藥物反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)外刺激、炎癥調(diào)節(jié)、膽汁酸受體活性和氧化還原酶活性等生物學(xué)過程。KEGG通路富集涉及的胰腺分泌、膽汁分泌、PPAR信號通路、 脂肪的消化吸收、花生四烯酸代謝及鈣信號通路等均與AP息息相關(guān)。AP模型早期事件之一就是胰酶持續(xù)合成，但胰管阻塞導(dǎo)致分泌受阻，胰酶被活化，并激活其他消化酶，導(dǎo)致胰腺組織自身消化性損傷[50-52]；膽總管遠(yuǎn)端阻塞導(dǎo)致膽汁逆流到胰管可激活胰腺酶原，膽汁酸以及不飽和脂肪酸均可引起腺泡細(xì)胞內(nèi)異常Ca2+信號，導(dǎo)致酶原激活、線粒損傷和細(xì)胞壞死[53-55]；花生四烯酸代謝網(wǎng)絡(luò)是產(chǎn)生炎癥遞質(zhì)的主要網(wǎng)絡(luò)，其代謝產(chǎn)物(前列腺素類、血小板活化因子和白三烯)會(huì)促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集和黏附，同時(shí)也提高血管通透性，進(jìn)而導(dǎo)致血栓出現(xiàn)并引起出血現(xiàn)象[9,18,55]。

綜上所述，本研究初步明確了六合丹是通過多成分、多靶點(diǎn)和多途通路發(fā)揮治療AP的作用機(jī)制的，為進(jìn)一步研究六合丹的藥理機(jī)制提供了初步探討與預(yù)測，確切的作用機(jī)制仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突