不同程度心理應(yīng)激對(duì)小鼠HPA軸及卵巢儲(chǔ)備功能的影響

劉妍，程蕊，孫若蕓，馬瑞紅，夏天

現(xiàn)代女性容易產(chǎn)生焦慮、抑郁等不良情緒，諸多不良情緒作為應(yīng)激原誘發(fā)心理應(yīng)激。若機(jī)體長期處于過度刺激狀態(tài)，超出自身調(diào)節(jié)范圍，則容易激發(fā)下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）軸系統(tǒng)功能變化[1]，更嚴(yán)重者心理應(yīng)激可干擾下丘腦-垂體-卵巢（hypothalamic-pituitary-ovarian，HPO）軸[2]，影響機(jī)體平衡，導(dǎo)致女性生殖內(nèi)分泌功能紊亂，體內(nèi)性激素分泌異常，生殖細(xì)胞因子和基因表達(dá)受阻，損害女性生殖能力，從而引發(fā)卵巢儲(chǔ)備功能下降、卵巢早衰以及不孕等生殖疾病。本研究通過檢測(cè)不同程度心理應(yīng)激下小鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotrophin releasing hormone，CRH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrendcorticotrophic hormone，ACTH）、皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）水平以及血清卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2）、抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）水平變化，并在光鏡下觀察各階段卵泡及其閉鎖情況，從而研究不同程度心理應(yīng)激對(duì)小鼠HPA軸應(yīng)激激素水平以及卵巢儲(chǔ)備功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 健康雌性未孕的4～5周齡ICR小鼠80只，SPF級(jí)，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量范圍22～26 g，平均（24.5±1.20）g。小鼠自購入后適應(yīng)性喂養(yǎng) 1～2 d，隨機(jī)分為4組，每組20只，正常組不給予任何干預(yù)，其余3組制備不同程度心理應(yīng)激小鼠模型，分為強(qiáng)刺激組、中刺激組和弱刺激組。

1.2 研究方法

1.2.1 不同程度心理應(yīng)激小鼠模型的制備 參照1991年Willner[3]的方法，并對(duì)其加以改進(jìn)。隨機(jī)給予小鼠慢性不可預(yù)見性刺激，方法包括：①禁水24 h；②禁食24 h；③夾尾10 min；④持續(xù)一整夜光照；⑤束縛30 min；⑥冰水游泳5 min；⑦濕墊24 h。以上刺激無規(guī)律進(jìn)行，避免一種刺激連續(xù)或有規(guī)律地出現(xiàn)，使動(dòng)物難以預(yù)知下次的刺激。正常組不給予任何干預(yù)；心理應(yīng)激模型強(qiáng)刺激組，每日給予2次不同的刺激；心理應(yīng)激模型中刺激組，每日給予1次不同的刺激；心理應(yīng)激模型弱刺激組，隔日給予1次不同的刺激。各組4周后同時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)，心理應(yīng)激小鼠模型均制備成功。

1.2.2 動(dòng)物取材與處理 連續(xù)給予實(shí)驗(yàn)小鼠刺激4周，于末次刺激24 h后，取其內(nèi)眥靜脈叢血，將收集于血清分離管中的全血標(biāo)本于室溫下放置2 h，然后1 000×g離心20 min，取其上清液，將上清液置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)小鼠血清CRH、ACTH、CORT 及 FSH、LH、E2、AMH 水平。

于麻醉狀態(tài)下將各組小鼠斷頸處死，剖腹取出雙側(cè)卵巢，置于10%的甲醛溶液中固定24 h以上，進(jìn)行梯度乙醇脫水處理，使用二甲苯充分透明小鼠卵巢組織，制作卵巢組織石蠟切片，將制作好的切片脫蠟復(fù)水，HE染色封固靜置后在光鏡下觀察各階段卵泡情況以及卵泡閉鎖情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組間趨勢(shì)采用線性趨勢(shì)檢驗(yàn)；進(jìn)一步組間兩兩比較時(shí)，若符合方差齊性，則采用LSD-t檢驗(yàn)；若不符合方差齊性，則采用Dunnett′s T3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組間小鼠血清應(yīng)激激素水平比較 經(jīng)不同程度刺激4周后，4組小鼠血清CRH、ACTH、CORT水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。弱、中、強(qiáng)刺激組小鼠血清CRH、ACTH、CORT水平均高于正常組（P＜0.01）；中、強(qiáng)刺激組小鼠血清CRH、ACTH、CORT水平均高于弱刺激組（P＜0.01）；強(qiáng)刺激組小鼠血清CRH、ACTH、CORT水平均高于中刺激組（P＜0.01）。隨著刺激強(qiáng)度的增加，小鼠血清CRH、ACTH、CORT 水平逐漸升高（Ptrend＜0.01），見表 1。

2.2 各組間小鼠血清性激素水平比較 經(jīng)不同程度刺激 4周后，4組小鼠血清 FSH、LH、E2、AMH 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。弱、中、強(qiáng)刺激組小鼠血清FSH、LH、E2、AMH水平均低于正常組（P＜0.01）；中、強(qiáng)刺激組小鼠血清 FSH、LH、E2、AMH水平均低于弱刺激組（P＜0.01）；強(qiáng)刺激組小鼠血清FSH、LH、E2、AMH 水平均低于中刺激組（P＜0.01）。隨著刺激強(qiáng)度的增加，小鼠血清FSH、LH、E2、AMH水平逐漸降低（Ptrend＜0.01）。見表 2。

表1 不同程度刺激4周后各組小鼠血清中應(yīng)激激素水平比較 （±s）

表1 不同程度刺激4周后各組小鼠血清中應(yīng)激激素水平比較 （±s）

注：a與正常組比較，P＜0.01；b與弱刺激組比較，P＜0.01；c與中刺激組比較，P＜0.01。

組別 n CRH（pg/mL） ACTH（pg/mL） CORT（ng/mL）正常組 20 3.90±0.36 3.80±0.92 1.87±0.48弱刺激組 20 5.90±0.59a 7.43±1.01a 2.58±0.36a中刺激組 20 8.29±0.47ab 13.00±0.65ab 4.10±0.65ab強(qiáng)刺激組 20 11.19±0.66abc 16.53±0.34abc 6.54±0.35abc F 698.662 1 073.471 376.187 P 0.000 0.000 0.000 Ftrend 2 081.412 3 194.092 1 063.331 Ptrend 0.000 0.000 0.000

表2 不同程度刺激4周后各組小鼠血清中性激素水平比較 （±s）

表2 不同程度刺激4周后各組小鼠血清中性激素水平比較 （±s）

注：a與正常組比較，P＜0.01；b與弱刺激組比較，P＜0.01；c與中刺激組比較，P＜0.01。

組別nFSH（ng/mL）LH（pg/mL）E2（pg/mL）AMH（ng/mL）正常組 20 31.49±1.57 417.17±13.17 63.43±2.14 6.24±0.10弱刺激組 20 23.25±2.06a 390.32±5.55a 43.43±0.53a 5.92±0.52a中刺激組 20 13.50±2.16ab 384.85±5.77ab41.67±1.56ab 5.64±0.10ab強(qiáng)刺激組 20 8.98±0.59abc363.33±7.29abc34.00±2.83abc5.33±0.13abc F 688.514 134.907 825.402 39.385 P 0.000 0.000 0.000 0.000 Ftrend 2 028.783 383.593 2 124.382 118.097 Ptrend 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 光鏡下各組小鼠卵巢組織中各階段卵泡及閉鎖卵泡情況檢測(cè)結(jié)果 正常組：卵巢體積大，皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，其內(nèi)可見原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、竇前卵泡、竇卵泡；黃體細(xì)胞豐富；卵泡液含量多，顆粒細(xì)胞層次豐富，卵丘形正常（見圖1A，見后插一）。弱刺激組：卵巢略有萎縮，卵泡生長稍減少，可見少量閉鎖卵泡（見圖1B，見后插一）。中刺激組：卵巢體積萎縮，各級(jí)卵泡數(shù)量減少，可見部分閉鎖卵泡（見圖1C，見后插一）。強(qiáng)刺激組：卵巢體積萎縮明顯，原始卵泡幾乎未見，各級(jí)卵泡數(shù)量明顯減少，卵泡液含量減少，卵丘變形或消失，閉鎖卵泡數(shù)量增多（見圖1D，見后插一）。

圖1 光鏡下各組小鼠卵巢組織（HE染色×100）

3 討論

心理應(yīng)激與機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌及生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)關(guān)系密切[4]，急慢性心理應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體HPA軸興奮，誘發(fā)神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)。HPO軸和HPA軸系統(tǒng)均起源于下丘腦，正常情況下女性生殖功能憑借HPO軸發(fā)生，下丘腦釋放促性腺激素釋放激素（GnRH）作用于垂體前葉，使促性腺激素如FSH、LH分泌，促性腺激素進(jìn)一步作用于卵巢，使其分泌性激素，以維持女性正常的生殖活動(dòng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性心理應(yīng)激可降低小鼠腦組織中去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）及 5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindoleaceticacid，5-HIAA）的含量以及小鼠內(nèi)生殖器濕質(zhì)量、陰道脫落細(xì)胞指數(shù)，導(dǎo)致性周期消失，抑制其生殖生理功能的發(fā)生[6]。說明心理應(yīng)激可激活HPA軸，致使其功能亢進(jìn)，抑制HPO軸，引發(fā)女性生殖功能障礙，導(dǎo)致女性出現(xiàn)暫時(shí)性不孕[7]。

HPA軸作為機(jī)體最主要的應(yīng)激反應(yīng)軸，支配著哺乳動(dòng)物應(yīng)對(duì)與適應(yīng)應(yīng)激反應(yīng)，而HPA軸的激活是機(jī)體保持自我平衡、維持穩(wěn)態(tài)的主要激素反應(yīng)[8]。長期暴露于應(yīng)激環(huán)境中，機(jī)體下丘腦室旁核會(huì)分泌大量的CRH，參與HPA軸神經(jīng)、精神和內(nèi)分泌等方面的綜合性應(yīng)答，從而引起外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生一系列反應(yīng)。CRH的釋放觸發(fā)腦垂體分泌ACTH，ACTH的存在通過體循環(huán)達(dá)到腎臟作用于腎上腺皮質(zhì)，產(chǎn)生CORT，一方面參與HPA軸的反饋調(diào)節(jié)[9]，另一方面調(diào)節(jié)機(jī)體諸多物質(zhì)的合成和分解代謝以維持機(jī)體日常功能[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)過長期慢性心理應(yīng)激后，致HPA軸功能亢奮，CRH、ACTH及CORT的水平均有所升高，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），并且模型組中3種激素的水平呈現(xiàn)出強(qiáng)刺激組＞中刺激組＞弱刺激組的表現(xiàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。表明心理應(yīng)激狀態(tài)下，下丘腦分泌的CRH促使垂體釋放較多的ACTH，而ACTH進(jìn)一步作用于腎上腺皮質(zhì)，使CORT分泌增多，HPA軸處于亢奮狀態(tài)。

女性生殖系統(tǒng)與應(yīng)激系統(tǒng)相似，存在雙向結(jié)構(gòu)[11]，下丘腦通過脈沖式釋放GnRH可引導(dǎo)機(jī)體多種功能有序發(fā)生，當(dāng)其依次作用于體內(nèi)腦垂體前葉，刺激促性腺激素（FSH、LH）的合成和分泌，二者協(xié)同作用于卵巢，促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟，調(diào)節(jié)E2的合成與分泌[12]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激狀態(tài)下，小鼠血清中FSH、LH及E2水平下降，且隨著刺激程度的增強(qiáng)，性激素水平降低。有研究表明，HPA軸與HPO軸關(guān)系密切，CRH是應(yīng)激抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)GnRH分泌的關(guān)鍵因素，其不但可以有效抑制垂體分泌促性腺激素，還能夠直接抑制卵巢合成雌激素[2,9]。心理應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體HPA軸被激活，中樞神經(jīng)系統(tǒng)分泌過多CRH，直接作用于GnRH神經(jīng)末端，阻滯其脈沖發(fā)動(dòng)，無法作用于垂體，致使FSH、LH分泌減少，降低芳香化酶的活性，進(jìn)而使E2合成及分泌減少，卵泡發(fā)育停滯，排卵功能障礙，閉鎖卵泡數(shù)量增多，從而導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備功能下降。

AMH可抑制芳香化酶的活性，減少顆粒細(xì)胞中LH受體數(shù)目，降低卵泡對(duì)FSH的敏感性，進(jìn)而調(diào)節(jié)優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇[13]。AMH水平在整個(gè)月經(jīng)周期并不會(huì)隨著性腺激素的波動(dòng)而發(fā)生改變[14]，可見女性AMH水平的檢測(cè)可于月經(jīng)周期的任何階段進(jìn)行，且檢測(cè)結(jié)果更趨于穩(wěn)定、有效。本研究結(jié)果顯示，各刺激組小鼠AMH水平均低于正常組，且隨著刺激程度的增強(qiáng)，AMH水平越低，光鏡下卵巢組織萎縮越明顯，各級(jí)卵泡數(shù)量減少，閉鎖卵泡數(shù)量增多。說明心理應(yīng)激可使小鼠AMH水平下降，卵泡發(fā)育水平降低，導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備功能下降，從而影響女性生殖功能。

綜上所述，心理應(yīng)激狀態(tài)下的小鼠HPA軸被激活，釋放大量的應(yīng)激激素，CRH、ACTH、CORT水平升高，抑制HPO軸功能，使垂體分泌的FSH、LH減少，雌激素生成障礙，卵泡發(fā)育障礙，致使竇前卵泡及竇狀卵泡數(shù)減少，閉鎖卵泡數(shù)量增加，從而使AMH分泌下降。因此，針對(duì)抑郁、焦慮情緒嚴(yán)重的育齡期女性，應(yīng)積極關(guān)注其心理狀態(tài)，治療過程中除了關(guān)注其卵巢功能外，還應(yīng)該適度增加心理輔導(dǎo)與治療，為臨床上治療女性卵巢儲(chǔ)備功能下降提供了新的參考方向。