基于Oncomine和TCGA數(shù)據(jù)庫探究TOP2A在卵巢癌中的表達(dá)及意義

張凱，劉玉林，胡佳麗，郭飛，薛鳳霞

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是全世界女性生殖系統(tǒng)腫瘤中預(yù)后最差、死亡率最高的婦科惡性腫瘤之一，文獻(xiàn)報(bào)道預(yù)計(jì)2019年美國卵巢癌新發(fā)病例數(shù)將達(dá)22 530例，其中13 980例患者因罹患卵巢癌而死亡[1]。與其他許多實(shí)體腫瘤一樣，卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展是一個涉及多因素、多種基因改變的復(fù)雜分子過程[2]。因此，尋找與卵巢癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)的關(guān)鍵基因，揭示關(guān)鍵基因在卵巢癌發(fā)病過程中的作用機(jī)制，為提供新的靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)。近年伴隨著高通量測序和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，腫瘤相關(guān)的數(shù)據(jù)庫成為挖掘腫瘤相關(guān)基因的工具，而Oncomine（www.oncomine.org）數(shù)據(jù)庫則是目前世界上最大的癌基因芯片數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫整合了GEO、TCGA和已發(fā)表文獻(xiàn)來源的RNA和DNA-seq數(shù)據(jù)，旨在用于探究腫瘤相關(guān)基因信息的數(shù)據(jù)挖掘平臺。癌癥和腫瘤基因圖譜（Cancer Genome Atlas，TCGA）計(jì)劃也是一種在線的腫瘤基因數(shù)據(jù)庫，通過更好地了解癌癥疾病的遺傳基礎(chǔ)，以期提高診斷、治療和預(yù)防癌癥的能力。

拓?fù)洚悩?gòu)酶ⅡA（topoisomeraseⅡA，TOP2A）基因編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα，它是一種在轉(zhuǎn)錄過程中控制和改變DNA拓?fù)錉顟B(tài)的酶，參與染色體的分離、DNA復(fù)制、染色質(zhì)濃縮等細(xì)胞生物學(xué)行為過程[3]。目前有研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌[4]、膀胱癌[5]、非小細(xì)胞肺癌[6]等多種實(shí)體腫瘤中均存在TOP2A基因的異常表達(dá)，但是關(guān)于該基因在卵巢癌中表達(dá)情況的研究較少，作用和功能仍不明確。因此，探究TOP2A基因在卵巢癌中的表達(dá)情況，及其與卵巢癌患者的臨床預(yù)后情況，幫助婦科腫瘤醫(yī)生更好地從分子生物學(xué)水平理解其發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，具有非常重要的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 從Oncomine數(shù)據(jù)庫中提取數(shù)據(jù) Oncomine數(shù)據(jù)庫是一個基因芯片集合的數(shù)據(jù)分析平臺，本研究從中篩選并提取出卵巢癌相關(guān)的數(shù)據(jù)，設(shè)定的篩選條件如下：①Cancer Type:ovarian cancer；②Gene:TOP2A；③Analysis Type:Cancer vs Normal Analysis；④Data Type:mRNA或DNA；⑤臨界值設(shè)定為：P-value ＜10－4，fold change ＞2，gene rank=top 10%。

1.2 TOP2A基因在上皮性卵巢癌中的突變情況 通過cBioPortal（www.cbioportal.org）網(wǎng)站獲得的TCGA數(shù)據(jù)庫中的606例上皮性卵巢癌樣本，其中311例具有完整的基因序列和拷貝變異資料，應(yīng)用oncoprint選項(xiàng)功能分析TOP2A基因變異情況。

1.3 TOP2A基因相關(guān)蛋白及其功能分析 利用STING數(shù)據(jù)庫分析TOP2A基因和相關(guān)蛋白，構(gòu)建TOP2A相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)樹狀圖，并進(jìn)行基因功能富集分析。

1.4 Kaplan-Meier Plotter對卵巢癌患者進(jìn)行生存分析通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫在線檢索卵巢癌患者的總體生存時間和無瘤進(jìn)展生存時間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正常卵巢組織和卵巢癌組織間比較采用t檢驗(yàn)，生存分析用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TOP2A基因在不同腫瘤中的表達(dá)情況 對Oncomine數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索分析后共納入涉及TOP2A基因相關(guān)性研究結(jié)果462項(xiàng)，挑選出高表達(dá)125項(xiàng)和低表達(dá)7項(xiàng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果進(jìn)一步分析。在膀胱癌中高表達(dá)6項(xiàng)，低表達(dá)0項(xiàng)；在腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中高表達(dá)10項(xiàng)；在乳腺癌中高表達(dá)18項(xiàng)，低表達(dá)1項(xiàng)；宮頸癌中高表達(dá)4項(xiàng)，低表達(dá)0項(xiàng)；在肺癌中高表達(dá)17項(xiàng)，低表達(dá)0項(xiàng)；其他腫瘤中高表達(dá)4項(xiàng)，低表達(dá)1項(xiàng)；卵巢癌中高表達(dá)的4項(xiàng)，低表達(dá)0項(xiàng)。見圖1（見后插二）。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫中TOP2A基因在不同類型腫瘤中的表達(dá)情況

2.2 TOP2A基因在卵巢癌中的表達(dá) 通過挖掘分析Oncomine數(shù)據(jù)庫涉及的TOP2A基因在卵巢癌組織和正常卵巢組織中有差異表達(dá)的7項(xiàng)研究，文章分別發(fā)表在《British Journal of Cancer》、《Cancer Research》、《ClinicalCancerResearch》、《ProceedingsoftheNational Academy of Sciences of USA》和《Cancer Science》。綜合分析發(fā)現(xiàn)，與對照組（正常卵巢組織）相比，TOP2A基因在所有差異表達(dá)基因中的中位數(shù)值排名為218.0，P=8.03×10-6，表明卵巢癌組織中TOP2A的表達(dá)量高于正常卵巢組織。見圖2（見后插二）。

圖2 Oncomine數(shù)據(jù)庫中TOP2A基因在卵巢癌中的表達(dá)情況

2.3 TOP2A基因在不同卵巢癌研究芯片中的表達(dá) 在 Adib Ovarian[7]、Bonome Ovarian[8]、Lu Ovarian[9]、Welsh Ovarian[10]、Yoshihara Ovarian[11]和 TCGA Ovarian 7項(xiàng)芯片中研究發(fā)現(xiàn)，有4項(xiàng)研究揭示在卵巢癌組織中TOP2A表達(dá)高于正常卵巢組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別是芯片研究 WelshOvarian（t=8.728，P＜0.05），LuOvarian（t=5.727，P＜0.05），TCGAOvarian（t=16.571，P＜0.05）和 Bonome Ovarian（t=11.064，P＜0.05）。Oncomine數(shù)據(jù)庫中TOP2A基因在不同卵巢癌芯片中的表達(dá)情況見圖3。綜合比較，TOP2A基因在卵巢癌組織與正常卵巢組織表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且在卵巢癌組織中高表達(dá)（P＜0.05）。

圖3 TOP2A基因在不同卵巢癌芯片中的表達(dá)情況

2.4 TOP2A基因在上皮性卵巢癌中的突變情況 在311例上皮性卵巢癌樣本中有12例發(fā)生TOP2A基因變異，突變率為4%，包括擴(kuò)增3例，深度缺失3例，截短突變3例，框內(nèi)突變1例，錯義突變2例，見圖4（見后插二）。

圖4 TOP2A基因在上皮性卵巢癌中的變異情況

2.5 TOP2A基因相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系及其功能分析 利用STING數(shù)據(jù)庫分析TOP2A基因主要相關(guān)蛋白，主要蛋白包括Discs大同源物關(guān)聯(lián)蛋白5（DLGAP5）、細(xì)胞分裂周期基因 20（CDC20）、泛素結(jié)合酶 E2C（UBE2C）、PDZ 結(jié)合激酶（PBK）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶1（TOP1）、非染色體結(jié)構(gòu)維護(hù)凝縮蛋白Ⅰ復(fù)合體G亞基（NCAPG）、非洲爪蟾驅(qū)動蛋白樣蛋白2靶蛋白（TPX2）、紡錘體檢測點(diǎn)絲/蘇氨酸激酶（BUB1）、細(xì)胞周期蛋白B2（CCNB2），構(gòu)建獲取TOP2A相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，見圖5（見后插二）。并將以上蛋白進(jìn)行生理過程富集分析，可發(fā)現(xiàn)其主要富集在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、細(xì)胞周期、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、P53信號通路等，見表1。

圖5 TOP2A相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)作用關(guān)系圖

2.6 TOP2A表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后的Kaplan-Meier生存分析 通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫對卵巢癌患者進(jìn)行生存分析，在線檢索TOP2A與卵巢癌患者的總體生存時間和無瘤進(jìn)展生存時間的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)TOP2A高表達(dá)的卵巢癌患者的總體生存時間和無瘤進(jìn)展生存時間明顯短于TOP2A低表達(dá)的卵巢癌患者（P＜0.05）。不同病理類型的卵巢癌亞組分析顯示，卵巢漿液性囊腺癌患者中TOP2A高表達(dá)組的總體生存時間與低表達(dá)組比較偏低，而2組無瘤進(jìn)展生存時間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌患者中TOP2A高表達(dá)組的無瘤進(jìn)展生存時間較低，總體生存時間與低表達(dá)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖6（見后插二）。

圖6 TOP2A的表達(dá)與卵巢癌預(yù)后之間的關(guān)系

3 討論

卵巢癌是最常見的三大惡性腫瘤之一，其病死率為婦科生殖道腫瘤之首[12]。中國每年新發(fā)病例約52 100例，且逐年增加，死亡病例約22 500例[13]。由于早期卵巢癌隱蔽性高，缺乏特異性的篩查指標(biāo)，許多患者發(fā)現(xiàn)時腫瘤細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移和腹腔擴(kuò)散，失去了最佳治療時期，目前晚期（Ⅲ～Ⅳ期）上皮性卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方案是腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合鉑類為基礎(chǔ)的化療，但是晚期患者很快出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且產(chǎn)生了對化療藥物的耐藥，導(dǎo)致了晚期卵巢癌患者的5年生存率低于30%，預(yù)后極差。因此，探究有效的卵巢癌基因生物標(biāo)志物對于了解腫瘤形成機(jī)制、患者預(yù)后和靶向藥物的治療起到關(guān)鍵作用。

表1 與TOP2A基因密切相關(guān)的基因及基因功能富集分析

TOP2A基因是位于人類17號染色體長臂12～21區(qū)域上，編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα，該核酶參與染色體濃縮，染色單體分離和催化雙鏈DNA鏈的瞬時斷裂和重新結(jié)合，使2條鏈可以彼此穿過，從而改變了DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，達(dá)到降低DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中發(fā)生扭轉(zhuǎn)應(yīng)力，避免打結(jié)和纏繞[14-15]。研究顯示，TOP2A基因在多種惡性實(shí)體瘤中異常高表達(dá)，且TOP2A高表達(dá)者通常惡性程度更高，預(yù)后更差。Ma等[16]研究發(fā)現(xiàn)TOP2A可以作為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后指標(biāo)，并且其可能通過與TPX2基因蛋白共同調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)展。Labbé等[17]對原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺癌進(jìn)行了全基因檢測分析，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺癌中TOP2A、果蠅Zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2（EZH2）mRNA水平和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，強(qiáng)調(diào)了前列腺癌細(xì)胞中的TOP2A和EZH2是驅(qū)動致癌基因的關(guān)鍵，通過聯(lián)合檢測TOP2A和EZH2基因，以早期識別可能受益于輔助或新輔助靶向治療方法的轉(zhuǎn)移潛力增加的患者。研究已發(fā)現(xiàn)與TOP2A陰性表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者相比，TOP2A過度表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌患者的總生存期和無病生存期更短，預(yù)后更差[18-19]。蒽環(huán)類藥物常被用作乳腺癌患者的術(shù)后輔助治療，研究發(fā)現(xiàn)TOP2A被認(rèn)為是這些藥物的分子靶點(diǎn)，因此，TOP2A擴(kuò)增和過表達(dá)在蒽環(huán)類藥物治療乳腺癌患者中具有潛在的預(yù)測價值[20]。Oncomine數(shù)據(jù)庫擁有全世界最全的癌癥基因芯片數(shù)據(jù)以及臨床信息，有利于研究者探索和發(fā)現(xiàn)新的癌癥生物標(biāo)志物和新的治療靶點(diǎn)。通過Oncomine數(shù)據(jù)分析可以得到不同腫瘤中癌基因的表達(dá)差異，還可以進(jìn)行富集和Meta分析，因其整合了大量數(shù)據(jù)的優(yōu)勢，避免了因?yàn)闃颖玖康膯栴}而導(dǎo)致的誤差，分析結(jié)果也因此具有較高的可信度。本研究發(fā)現(xiàn)TOP2A基因在膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌以及肺癌等不同類型腫瘤中的表達(dá)，總共132項(xiàng)研究存在TOP2A的差異表達(dá)，其中包括125項(xiàng)高表達(dá)和7項(xiàng)低表達(dá)。

TOP2A基因在腫瘤中的作用及其機(jī)制尚不明確，本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫中相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其在卵巢癌患者中的總體突變率為4%，且變異以擴(kuò)增、深度缺失和截短突變?yōu)橹?。通過STRING蛋白分析工具篩選出與TOP2A蛋白發(fā)生相互作用的10種蛋白DLGAP5、CDC20、UBE2C、PBK、CDK1、TOP1、NCAPG、TPX2、BUB1和CCNB2，對這些蛋白進(jìn)行通路途徑的富集分析可知，主要參與了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、細(xì)胞周期、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、P53信號通路和泛素介導(dǎo)的蛋白水解等生理過程。Xiong等[21]認(rèn)為TOP2A可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和p53信號通路，從而影響吸煙相關(guān)性腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。宮頸癌常由人乳頭瘤病毒（HPV）引起，病毒感染人體之后導(dǎo)致p53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白分別被病毒腫瘤蛋白E6和E7滅活，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期的紊亂，TOP2A和ki-67等核蛋白由于細(xì)胞分裂增加而表達(dá)也明顯增加，因此聯(lián)合TOP2A抗體和ki-67抗體檢測可應(yīng)用于宮頸癌的免疫組織化學(xué)進(jìn)行篩查[22-23]。Zhang等[24]研究顯示TOP2A在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，體外實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染特異性小干擾RNA，使結(jié)腸癌細(xì)胞中TOP2A基因沉默，從而導(dǎo)致TOP2A蛋白的表達(dá)缺失，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖和侵襲能力，而這一現(xiàn)象可能的潛在機(jī)制為敲除TOP2A不僅影響細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（bcl-2和bax）和侵襲相關(guān)蛋白（MMP-2和MMP-9）的表達(dá)，還降低了細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和蛋白激酶B（AKT）的磷酸化水平。

Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫是用來預(yù)測基因與腫瘤預(yù)后相關(guān)的在線分析平臺。本研究發(fā)現(xiàn)TOP2A與卵巢癌患者的總體生存率和無瘤進(jìn)展率存在負(fù)相關(guān)，即高表達(dá)TOP2A卵巢癌患者的總體生存時間和無瘤進(jìn)展生存時間要短于TOP2A低表達(dá)者。進(jìn)一步分層分析發(fā)現(xiàn)，TOP2A表達(dá)水平對卵巢漿液性囊腺癌患者的總體生存時間的影響較卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌的總體生存時間影響更為顯著，相反，TOP2A對卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌患者的無瘤進(jìn)展生存時間影響較卵巢漿液性囊腺癌患者的無瘤進(jìn)展生存時間影響大。Ferrandina等[25]研究表明在高級別卵巢癌和晚期疾病中觀察到TOP2A mRNA表達(dá)顯著升高，并且核TOP2A蛋白過表達(dá)的患者總體生存時間明顯降低。此外，F(xiàn)aggad等[26]也發(fā)現(xiàn)TOP2A在卵巢癌組織中高表達(dá)，并且表達(dá)量越高預(yù)后越差。TOP2A基因編碼的拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα與細(xì)胞的分裂增殖密切相關(guān)，而拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα的異常高表達(dá)則加快了斷裂卵巢腫瘤細(xì)胞中DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)鏈，促進(jìn)DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，從而增加了腫瘤細(xì)胞的分裂增殖能力，導(dǎo)致卵巢癌患者預(yù)后不良[27-28]。

綜上，基于Oncomine數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)TOP2A在卵巢癌組織中高表達(dá)，且與卵巢癌患者的預(yù)后有關(guān)，術(shù)前評估卵巢癌患者中TOP2A表達(dá)，這可能有助于評估患者的風(fēng)險(xiǎn)狀況、預(yù)后和預(yù)測價值。同時為TOP2A作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)提供新的依據(jù)，也為卵巢癌的治療提供新的方向。