miRNA-200a調(diào)控淋巴瘤細(xì)胞增殖遷移的機(jī)制

農(nóng)衛(wèi)霞 王奎 張蕾 王新華 龍珍珠瑪

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1第一附屬醫(yī)院血液風(fēng)濕科，新疆 石河子 832008；2預(yù)防醫(yī)學(xué)系；3第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；4石河子市人民醫(yī)院病理科)

淋巴瘤是免疫系統(tǒng)的實(shí)體瘤。在病理學(xué)分類上，霍奇金淋巴瘤約占所有淋巴瘤的10%，其余90%被稱為非霍奇金淋巴瘤〔1〕。淋巴瘤患者的組織學(xué)表現(xiàn)和臨床特征具有異質(zhì)性，其診斷和治療比較困難，因此尋找新的治療靶點(diǎn)用于鑒別診斷、制定治療方案和評(píng)估預(yù)后等具有重要意義。微小RNAs(miRNAs)是一類高度保守的短鏈非編碼RNA，通過(guò)與mRNA末端非翻譯區(qū)特異性的結(jié)合從而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。miRNAs的異常表達(dá)對(duì)于腫瘤的形成有著重要的作用。miRNA-200a來(lái)源于miRNA-200家族中，已有研究表明其參與肝癌、乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡等過(guò)程〔2～4〕。目前已有許多miRNAs與淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但miRNA-200a與淋巴瘤的聯(lián)系并不清楚。磷酸酶和張力蛋白同源(PTEN)基因作為第一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色體10q23.3區(qū)，其編碼的蛋白具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性。當(dāng)PTEN表達(dá)發(fā)生變化可改變對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)性調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)異常，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前已知多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)存在PTEN基因的突變，如前列腺、乳腺癌和淋巴瘤等〔5,6〕。本文在彌漫大細(xì)胞B淋巴瘤細(xì)胞系DOHH-2中干擾miRNA-200a的表達(dá)，觀察細(xì)胞增殖與遷移能力的改變，并探討其分子機(jī)制，為淋巴瘤的臨床治療提高新的靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1材料 DMME培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度、Lipofectamine 2000測(cè)定試劑盒均購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司；CCK-8試劑盒(上海炎熙生物科技有限公司)；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒(蘇州宇恒生物科技有限公司)；鼠抗人miRNA-200a、PTEN單抗及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)二抗均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；免疫組化SP900染色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)；MiniAmp PCR儀(美國(guó)ABI公司)；DYCZ-24KF電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) DOHH-2細(xì)胞(上海素爾生物科技有限公司)，采用含有10%胎牛血清及1%青霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于在37℃、95%相對(duì)濕度、5%CO2培養(yǎng)箱，隔天更換培養(yǎng)液，細(xì)胞融合度約為80%則進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)期細(xì)胞種植于12孔板，每孔細(xì)胞密度為1×106個(gè)1細(xì)胞，分為3組：對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，陰性對(duì)照組及miRNA-200a轉(zhuǎn)染組根據(jù)Lipofectamine 2000說(shuō)明書轉(zhuǎn)染。

1.4qRT-PCR檢測(cè)miRNA-200a和PTEN mRNA表達(dá) DOHH-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染的24 h后，采用qRT-PCR法檢測(cè)miRNA-200a和PTEN的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)材料miRNA-200a特異性引物、內(nèi)參材料U6引物及其他相應(yīng)的引物組分可匹配成20 μl的聯(lián)合反應(yīng)引物體系(反應(yīng)混合物10 μl、上下游引物各0.8 μl，DNA(每模板2 μl,ddH2O 6.4 μl)，以95℃ 5 min(1個(gè)連續(xù)循環(huán))、95℃ 30 s(35個(gè)連續(xù)循環(huán))、58℃ 30 s(35個(gè)連續(xù)循環(huán))、72℃ 2 min(35個(gè)連續(xù)循環(huán))和72℃ 6 min(1個(gè)連續(xù)循環(huán))的綜合反應(yīng)量為條件分別進(jìn)行了PCR的擴(kuò)增。以β-肌動(dòng)蛋白(actin)為基礎(chǔ)內(nèi)參。應(yīng)用2-△△Ct法則可計(jì)算義為miRNA-200a的相對(duì)函數(shù)表達(dá)式向量。每組重復(fù)6次。miRNA-200a和PTEN的引物見表1。

1.5免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)miRNA-200a和PTEN蛋白表達(dá) DOHH-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染的24 h后，總細(xì)胞蛋白質(zhì)使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定法測(cè)量。用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)樣品并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶在PBST中封閉1 h。在4℃下與miRNA-200a(1∶1 000)及PTEN(1∶500)抗體溫育過(guò)夜，將聚偏氟乙烯膜用含TBST的緩沖鹽水洗滌，與HRP綴合的山羊抗兔或馬抗小鼠二抗在室溫下孵育2 h，使用化學(xué)發(fā)光使蛋白帶可視化，β-actin為內(nèi)參。每組重復(fù)6次。

表1 引物序列

1.6CCK8檢測(cè)DOHH-2細(xì)胞增殖 將DOHH-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染的24 h后，每孔中加入10%的CCK8溶液，孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm細(xì)胞處的光密度的數(shù)值，計(jì)算DOHH-2細(xì)胞的存活率。每組重復(fù)6次。

1.7劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DOHH-2細(xì)胞遷移 將DOHH-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染的24 h后，將各組細(xì)胞調(diào)整至相同的濃度接種于12孔板，待貼壁細(xì)胞出現(xiàn)貼壁懸浮后頭迅速進(jìn)行清理劃痕，用PBS迅速洗去貼壁懸浮得來(lái)的細(xì)胞，并重新加入RPMI1640培養(yǎng)基。在顯微鏡下記錄不同時(shí)間點(diǎn)下DOHH-2細(xì)胞劃痕的寬度，計(jì)算DOHH-2細(xì)胞遷移速率。每組重復(fù)6次。

1.8統(tǒng)計(jì)方法 采用Graphpad Prism6進(jìn)行單因素方差分析、SNQ檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞miRNA-200a、PTEN mRNA及蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組或陰性對(duì)照組比，miRNA-200a轉(zhuǎn)染組的miRNA-200a水平顯著增高(P<0.05)，PTEN水平顯著降低(P<0.05)，對(duì)照組和陰性對(duì)照組的miRNA-200a、PTEN mRNA及蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這表明miRNA-200a干擾模型構(gòu)建成功，miRNA-200a mRNA負(fù)調(diào)控PTEN mRNA及蛋白的表達(dá)。見表2和圖1、2。

2.2各組細(xì)胞的增殖和遷移 與對(duì)照組或陰性對(duì)照組比，miRNA-200a轉(zhuǎn)染組的相對(duì)細(xì)胞活力和細(xì)胞遷移速率明顯增高(P<0.05)，這表明miRNA-200a依賴PTEN調(diào)控DOHH-2細(xì)胞的增殖和遷移。見表2。

表2 各組miRNA-200a、PTEN mRNA和蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖和遷移比較

與對(duì)照組比：1)P<0.05，與陰性對(duì)照組比：2)P<0.05

1：對(duì)照組；2：陰性對(duì)照組；3：miRNA-200a轉(zhuǎn)染組；圖2同圖1 miRNA-200a及PTEN mRNA表達(dá)

圖2 miRNA-200a及PTEN蛋白表達(dá)

3 討 論

miRNAs是一類長(zhǎng)度為18～22 bp的非編碼RNA，其對(duì)于調(diào)控靶向mRNAs的基因表達(dá)十分重要〔7,8〕。最初在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了miRNAs導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象〔9〕。miRNAs參與多種生命過(guò)程，包括細(xì)胞凋亡、分化和增殖。它們涉及多種疾病，如免疫系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤〔10〕。以往的證據(jù)表明許多miRNAs參與腫瘤發(fā)生。盡管miRNA僅占哺乳動(dòng)物基因組的1%，但超過(guò)50%的miRNA基因位于與癌癥中的突變的DNA序列中〔11〕。許多腫瘤的miRNA表達(dá)譜發(fā)生了特異性的改變，例如，在B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病中miR-15和miR-16通常是下調(diào)或是被刪除的，在Burkitt淋巴瘤患者中miR-155上調(diào)了100倍〔11〕。miRNAs可能作為癌基因和抑癌基因參與對(duì)腫瘤的調(diào)控〔10〕。

PTEN是最常見的腫瘤抑制因子之一，該基因的缺失與癌癥顯著相關(guān)，例如50%～80%的子宮內(nèi)膜癌患者中該基因發(fā)生了突變〔12〕。通過(guò)抑制蛋白酶B(AKT)和磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)，PTEN調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中十分重要〔13〕。已有研究報(bào)道了淋巴瘤患者中PTEN表達(dá)下調(diào)。一項(xiàng)研究表明，在11個(gè)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系中有7個(gè)完全喪失了PTEN功能，這表明彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤可能與PTEN缺失有關(guān)。PTEN表達(dá)的缺失也與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者較差的生存率有關(guān)〔6〕。一些miRNAs，如miR-19a和miR-155等，可以通過(guò)調(diào)控PTEN進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)生〔14〕。

在本研究中，與對(duì)照組或陰性對(duì)照組比，DOHH-2細(xì)胞中miRNA-200a mRNA及蛋白表達(dá)的干擾導(dǎo)致PTEN的mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，表明miRNA-200a干擾模型構(gòu)建成功，miRNA-200a mRNA負(fù)調(diào)控PTEN mRNA及蛋白的表達(dá)，CCK8和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，miRNA-200a轉(zhuǎn)染組的相對(duì)細(xì)胞活力和細(xì)胞遷移速率明顯增高，表明miRNA-200a依賴PTEN調(diào)控DOHH-2細(xì)胞的增殖和遷移，本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道類似〔15,16〕。

綜上所述，miRNA-200a調(diào)控DOHH-2細(xì)胞增殖與遷移能力，其機(jī)制可能與調(diào)控PTEN的表達(dá)有關(guān)。