血小板衍生生長(zhǎng)因子B鏈在pN0期非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的關(guān)系

魏東 薛志芳 劉博 王耀一 郝雁冰

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000)

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)發(fā)病率占肺癌的85%左右，約75%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是晚期，錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)，據(jù)統(tǒng)計(jì)5年的生存率只有15%〔1〕。最近研究指出〔2〕，NSCLC患者治療的預(yù)后及復(fù)發(fā)情況與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生關(guān)系密切〔3〕，即使在Ⅰ期NSCLC行根治手術(shù)后仍會(huì)有約40%的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移〔4〕，說(shuō)明根治手術(shù)的區(qū)域淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處組織中可能有著腫瘤的微轉(zhuǎn)移病灶〔5,6〕。清楚準(zhǔn)確的知道pN0期NSCLC患者是否有淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移灶形成是評(píng)判NSCLC患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。隨著人們對(duì)分子學(xué)的不斷探索，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)有無(wú)微轉(zhuǎn)移灶與血小板衍生生長(zhǎng)因子B鏈(PDGF-B)的表達(dá)之間存在某種聯(lián)系。本研究旨在探討PDGF-B在pN0期NSCLC中的表達(dá)及與淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料 2017年7月至2018年7月就診于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院50例肺癌(152枚淋巴結(jié))根治術(shù)后經(jīng)病理檢查證實(shí)為pN0期〔7〕的NSCLC患者，及22例癌旁組織，石蠟包埋標(biāo)本；年齡46～75歲，平均(52.3±11.2)歲。其中鱗癌32例，腺癌18例。按國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC2002)標(biāo)準(zhǔn)分期：ⅠA期18例、ⅠB期21例、ⅡB期11例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者病例資料齊全；②既往無(wú)相關(guān)化療、手術(shù)等治療史者；③所有非小細(xì)胞癌患者進(jìn)行根治性肺葉切除術(shù)，患者手術(shù)方式為肺葉切除加系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃術(shù)。④所有肺癌患者的重要功能臟器正常且可耐受手術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)中發(fā)現(xiàn)腫瘤已經(jīng)向肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的患者；②淋巴縱隔疾病患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)會(huì)審查并通過(guò)，患者及家屬知情且同意。

1.2研究材料 兔抗人 PDGF-B多克隆抗體(IgG型)；北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司的SABC 試劑盒；細(xì)胞角質(zhì)蛋白(CK)；美國(guó) Hy-clone 公司的磷酸鹽緩沖液(PBS)。

1.3研究方法 本研究手術(shù)后的標(biāo)本用中性福爾馬林液固定，并將其用石蠟包埋處理，隨機(jī)選擇常規(guī)病理檢查陰性肺門(mén)淋巴結(jié)。制備連續(xù)的2個(gè)厚度為4 μm的石蠟切片，并進(jìn)行免疫組化鏈霉菌蛋白生物素(LSAB)法脫蠟與水化；進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色和小鼠抗人CK(廣譜)抗體免疫組織化學(xué)(SP)染色。對(duì)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本按常規(guī)制作蠟塊，石蠟切片每例3張，并以PDGF-B多克隆抗體進(jìn)行SP染色。具體步驟如下：石蠟切片經(jīng)脫蠟及水化，使用pH7.4的PBS沖洗3次，每次3 min。將所有切片放入pH=7.4的PBS溶液中，分別在微波爐的中及高檔火中各烤5 min，并且對(duì)組織抗原進(jìn)行修復(fù)。每張切片加滴1滴3% H2O2，24℃下孵育10 min，來(lái)使內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性喪失。PBS連續(xù)沖洗3次，每次3 min，去掉PBS。在切片上滴1滴第一抗體，24℃下孵育60 min。PBS沖洗3次每次3～5 min。去掉PBS溶液，每張切片滴加l滴MaxVsion溶液，24℃下孵育10～15 min。PBS沖洗3次，每次3 min。去掉PBS，滴加2滴二氨基聯(lián)苯胺(DAB)液于切片上。二抗、鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)反應(yīng)各20 min(1∶100，20～37℃)；DAB鏡下調(diào)控染色程度，流動(dòng)水沖洗10 min；蘇木素核復(fù)染；脫水、透明、封片、觀察。每1步驟中間均用pH7.4、濃度為0.01 mol/L的PBS沖洗3～4次，每次3～5 min。

1.4觀察指標(biāo) 采用單盲法，病理科醫(yī)師不清楚患者臨床資料的情況下進(jìn)行操作。評(píng)估患者PDGF-B的表達(dá)及淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移情況。陽(yáng)性細(xì)胞：細(xì)胞著色棕黃色顆粒或細(xì)胞線網(wǎng)狀。按照切片中陽(yáng)性細(xì)胞占比及細(xì)胞著色程度分成0～3分：0分=切片中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為零；1分=陽(yáng)性細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù)的占比<25%/5個(gè)高倍視野；2分=陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)為25%～50%；3分=陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)>50%；染色深度：0分=沒(méi)有陽(yáng)性細(xì)胞；1分=大多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞顯色為黃色；2分=大多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞顯色棕黃色；3分=大多數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞顯色棕褐色。再將這兩項(xiàng)指標(biāo)相加，總分分成4級(jí)：-：0分；+：1～2 分；：3～4分；：5～6分。陽(yáng)性表達(dá)：+、、。陽(yáng)性表達(dá)即淋巴結(jié)的切片中出現(xiàn)1個(gè)以上的胞膜及胞質(zhì)內(nèi)黃染，該淋巴結(jié)切片即存在微轉(zhuǎn)移灶。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1pN0期NSCLC患者原發(fā)癌灶與癌旁組織中PDGFR-B表達(dá)比較 pN0期NSCLC組織中PDGF-B陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織(P<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 pN0期NSCLC患者原發(fā)癌灶與癌旁組織中PDGF-B表達(dá)比較(n)

2.2pN0期NSCLC的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移檢測(cè)的結(jié)果 16/50例pN0期NSCLC患者中檢測(cè)出現(xiàn)淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移灶；152枚淋巴結(jié)中，以CK表達(dá)陽(yáng)性認(rèn)為淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，CK表達(dá)陽(yáng)性率為28/152(18.42%)。15例病理診斷轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)CK表達(dá)為陽(yáng)性表達(dá)；2 例良性患者10枚淋巴結(jié)表達(dá)為陰性。

pN0期NSCLC患者PDGF-B表達(dá)與患者的性別、年齡、病程、腫瘤直徑及病理類型無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)，但與臨床分期有關(guān)，ⅠB期和ⅡB期肺癌的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯高于ⅠA期(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 pN0期非小細(xì)胞肺癌患者淋巴結(jié)PDGFR-B表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

肺癌已成為中國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一〔8,9〕。盡管近年來(lái)肺癌的診斷和治療研究已經(jīng)取得進(jìn)展，但肺癌的存活率并未顯著提高。即使在NSCLC患者接受根治性手術(shù)后，復(fù)發(fā)率仍然很高〔10,11〕，PDGF是廣泛分布于人體各種器官中的有絲分裂原及化學(xué)趨化劑。PDGF能夠通過(guò)與其受體PDGFR相結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)酪氨酸激酶磷酸化反應(yīng)的發(fā)生，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和新血管的形成，并促進(jìn)腫瘤的繼續(xù)生長(zhǎng)〔12〕。PDGF及其受體在許多惡性腫瘤組織中的高表達(dá)在腫瘤的發(fā)展中起作用〔13〕。研究證實(shí)，PDGFs在促進(jìn)淋巴管生成中起重要作用。PDGF-B是PDGF家族成員的受體之一，主要在間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，并在組織生長(zhǎng)和發(fā)育中起重要作用。目前的研究發(fā)現(xiàn)PDGF-B在胃癌基質(zhì)中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)〔14〕。

已經(jīng)有研究多種腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展與 PDGF-B的異常表達(dá)密切相關(guān)〔15,16〕。人體第22號(hào)染色體上的PDGF-B編碼基因在正常狀態(tài)下，很少見(jiàn)其蛋白的表達(dá)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，原癌基因c-sis經(jīng)過(guò)活化后的編碼產(chǎn)物與PDGF-B具有同源性〔17〕，PDGF-B的純合二聚體PDGF-B是具有強(qiáng)的有絲分裂原的作用，并已經(jīng)證實(shí)NSCLC存在c-sis基因被活化的現(xiàn)象〔18〕。PDGF能夠促使不同種類的細(xì)胞加速增殖與分裂進(jìn)程，但是這種生物學(xué)反應(yīng)僅在PDGF-B與其受體結(jié)合后才能實(shí)現(xiàn)。PDGF-B 的受體種類很多，單獨(dú)PDGFR 來(lái)說(shuō)，它不僅可以與PDGFR-β相結(jié)合，也可以和PDGFR-α相結(jié)合。曾有學(xué)者檢測(cè)肺癌中的 PDGFR-β的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PDGFR-B只能在細(xì)胞基質(zhì)中表達(dá)，這說(shuō)明在NSCLC細(xì)胞中PDGF-B高度表達(dá)，PDGF-B的表達(dá)與肺癌的分化程度之間的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道不一致，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示 PDGF-B的陽(yáng)性表達(dá)與pN0期NSCLC的臨床分期有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)〔19〕，結(jié)直腸癌PDGFR-α染色強(qiáng)度隨腫瘤細(xì)胞分化程度的增加而增加。PDGFR-α是否在肺癌中發(fā)揮作用與結(jié)直腸癌相似仍有待研究。

CK是參與細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞結(jié)構(gòu)和運(yùn)動(dòng)的蛋白質(zhì)，它廣泛存在于上皮組織細(xì)胞中，并且在間充質(zhì)組織如淋巴結(jié)，血液和骨髓中缺乏表達(dá)。源自上皮組織的NSCLC保留了上皮組織的特征，例如肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中CK5、6、8、14、16和19蛋白的強(qiáng)表達(dá)〔20〕。只要在常規(guī)病理學(xué)陰性的淋巴結(jié)中檢測(cè)到CK成分，就可以考慮在NSCLC患者中存在微轉(zhuǎn)移。因此，CK是檢測(cè)NSCLC淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)化的敏感和特異性標(biāo)志物。以前為了能夠檢測(cè)出擴(kuò)散到遠(yuǎn)處區(qū)域淋巴結(jié)中的少量腫瘤細(xì)胞，使用了大量連續(xù)的切片、HE染色和常規(guī)組織病理學(xué)檢查。該法不僅浪費(fèi)時(shí)間又與實(shí)際不相符合。SP染色利用抗原-抗體反應(yīng)，可以將抗體稀釋成千上萬(wàn)倍的濃度。兩者均具備檢測(cè)組織中抗原成分的高靈敏度和特異性。本研究采用SP檢測(cè)以CK為標(biāo)志物的肺癌患者淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移，這是一種合理的選擇。

總之，PDGF-B在NSCLC的發(fā)生，發(fā)展和分化中起重要作用。毛利偉等〔21〕用同構(gòu)構(gòu)建動(dòng)物模型輻射誘導(dǎo)的方法來(lái)抑制肺腺癌的生長(zhǎng)方面，并取得了一些進(jìn)展。Reinmuth等〔22〕也發(fā)現(xiàn)體外大黃素可能通過(guò)抑制PDCF-B和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1的表達(dá)而發(fā)揮抗纖維化作用。PDGF-B和PDGFR-α是否可以作為治療NSCLC的新突破仍有待進(jìn)一步研究。