TGF-β1參與調(diào)控LMP1介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究

姚曉媛，宋曉環(huán)，王忠超，鐘志偉

(長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，長春 130031)

EB病毒(EBV)不僅是單核細(xì)胞增多癥的一個病原體，也是一個比較重要的DNA腫瘤病毒，與T/B淋巴細(xì)胞瘤、何杰金病以及鼻咽癌等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。而潛伏膜蛋白1(LMP1)作為EBV的一個致瘤蛋白，能夠在體外向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，具有抑制細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及介導(dǎo)細(xì)胞增殖的功能，與NPC低分化有關(guān)，并且可以對腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲起到一定的促進(jìn)作用[1]。而轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)可以調(diào)控細(xì)胞的分化和生長，并且腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與其傳導(dǎo)紊亂和表達(dá)異常有關(guān)。本研究對LMP1介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中TGF-β1的參與作用進(jìn)行了研究，報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

本研究細(xì)胞系包括HCG-27和SCG-7901為EBV陰性胃癌細(xì)胞系、SNU719陽性胃癌細(xì)胞系。其中，培養(yǎng)液為鏈霉素100 mg/L、青霉素100 kU/L以及胎牛血清，并且按照常規(guī)方法培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2 主要試劑

研究試劑包括TGF-β1、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑以及RNA提取試劑。

1.3 方法

1.3.1 siRNA649轉(zhuǎn)染

GT38為表達(dá)LMP1的EVB陽性細(xì)胞系分為5組，分別是TGF-β1處理組、siRNA649+TGF-β1處理組、siRNA649處理組、Lip2000對照組以及細(xì)胞對照組。其中，TGF-β1處理組運(yùn)用70%～80%細(xì)胞匯合度的單層細(xì)胞，將培養(yǎng)液去掉后，運(yùn)用PBS液進(jìn)行2次洗滌，然后將DMEM培養(yǎng)液加入繼續(xù)培養(yǎng)。而siRNA649處理組轉(zhuǎn)染前1 d，運(yùn)用無抗生素培養(yǎng)基對GT38細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度為30%～50%時，運(yùn)用脂質(zhì)體法以50 nmol/L的濃度將特異性siRNA649轉(zhuǎn)染為GT38細(xì)胞。同時，TGF-β1+siRNA649處理組轉(zhuǎn)染后，將濃度為10 mg/L的TGF-β1加入進(jìn)行處理。上述各組經(jīng)過48 h作用后，將培養(yǎng)液棄去，運(yùn)用胰蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行收集，運(yùn)用PBS對細(xì)胞進(jìn)行2次洗滌，并運(yùn)用TRIzol一步法對細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取。

1.3.2 檢測轉(zhuǎn)錄水平

選擇細(xì)胞總RNA為模板，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，將cDNA合成進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)內(nèi)參照基因GAPDH、LCAM-1、EGFR、CDK4、Survivin、MMP9以及LMP1的引物，并且運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)對電泳結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 siRNA649轉(zhuǎn)染后LMP1 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

采用50 nmol/L終濃度siRNA649對GT38細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，待48 h后，對各組細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取，并運(yùn)用RT-PCR對LMP1 mPRN轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，LMP1 mRNA轉(zhuǎn)染后表達(dá)缺失，見圖1。

2.2 TGF-β1對不同因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

TGF-β1作用HCG-27、SGC7901、SNU719以及GT38細(xì)胞系48 h后，GT38細(xì)胞系ICAM-1的表達(dá)明顯低于對照組(P<0.05)，但是在其他細(xì)胞中表達(dá)比較無差異(P>0.05)。同時，TGF-β1作用前后，4種細(xì)胞系的表達(dá)對比無統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)，見表1。

圖1 RT-PCR檢測的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

表1 各組的轉(zhuǎn)錄表達(dá)灰度值

3 討論

EBV作為人類的一個腫瘤病毒，其與上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞源性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，而LMP1編碼基因作為公認(rèn)的一個病毒癌基因。本研究發(fā)現(xiàn)，在EBVaGC的發(fā)生和發(fā)展中，LMP1發(fā)揮著極其重要的作用。MMPs作為ECM降解的一個重要酶類，多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移與其過度表達(dá)有關(guān)，并且在上皮細(xì)胞中，LMP1能夠?qū)MP9表達(dá)發(fā)揮一定的誘導(dǎo)作用[2]。Survivin作為凋亡抑制的一種蛋白，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，對細(xì)胞凋亡進(jìn)行抑制，調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂，并且對腫瘤轉(zhuǎn)移和生長起到一定的促進(jìn)作用[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，升高CDK4 mRNA表達(dá)后，可下調(diào)Survivin轉(zhuǎn)錄表達(dá)，并且LMPI能夠利用AP-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對Survivin表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而參與EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。同時，LMP1能夠活化NF-κB和磷酸化ERK1/2，對TGF-β1調(diào)控生長進(jìn)行抑制，并且TGF-β1對GT38細(xì)胞系產(chǎn)生直接作用后，還能明顯降低ICAM-1表達(dá)。

綜上所述，LMP1沉默后能夠?qū)CAM-1、Survivin以及MMP9表達(dá)進(jìn)行抑制，有助于CDK4表達(dá)，并且LMP1與TGF-β1參與介導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)有關(guān)。