健脾固腸方通過提高短鏈脂肪酸產生菌的豐度減輕腸癌小鼠化療后腸道炎癥反應的機制探討?

周張杰，蔣海燕，鐘 薏Δ，沈 偉，李 蕓，付淑娟，吳婷婷，夏曉婷，張士強，楊 蘊，劉新華

(1.上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院腫瘤科，上海 200082；2.上海交通大學附屬新華醫(yī)院肛腸外科，上海 200092；3.上海中醫(yī)藥大學科技實驗中心，上海 201203)

化療是治療結腸癌的重要方法之一，但其容易導致腸道菌群失調，引起惡心、嘔吐、腹瀉等并發(fā)癥，這些并發(fā)癥嚴重影響化療期間結腸癌患者的生活質量，導致化療中止甚至危及生命[1-2]。腸道微生物群會通過緊密連接腸道上皮細胞調節(jié)宿主腸道微環(huán)境，并最終影響腸道屏障[3]。

中醫(yī)臨床采用辨證治療的方法，認為脾氣不足可導致腸黏膜血流停滯，進而使腸黏膜的防御功能變弱，最終導致腸黏膜損傷[4]。相關研究表明，四君子湯可以促進大鼠正常腸上皮細胞的增殖，有助于恢復腸黏膜的免疫平衡[5]。健脾固腸方以四君子湯為底方進行加減，發(fā)現(xiàn)該方能降低化療后患者的二胺氧化酶、D-乳酸水平(P<0.05)，說明該方能明顯降低患者腸道屏障的損傷[6]。但其機理不明，于是進行基礎實驗驗證其是否通過調節(jié)腸道菌群緩解腸道炎癥反應，進而減輕患者化療后腸道屏障的損傷。

1 材料

1.1 細胞與動物

1.1.1 實驗動物 Balb/cSPF級雄性小鼠14只，4～6周齡，購自上海斯萊克有限公司動物，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物試驗中心。本實驗通過上海中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審查。

1.1.2 細胞 鼠源CT26.WT結腸癌細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2 實驗器材

胎牛血清、PBS、RPMI-1640培養(yǎng)基，購自Gibco有限公司；健脾固腸方中藥顆粒劑組成：黨參、白術、茯苓、甘草等，購自江陰天江藥業(yè)有限公司。取蒸餾水定容至1.443 g/ml；奧沙利鉑50 mg，購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；5-氟尿嘧啶10 ml：0.25 g，購自天津金耀氨基酸有限公司；0.9%氯化鈉溶液，購自凱恒有限公司；組織膠水，購自德國博朗有限公司；異氟烷，購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；動物麻醉機，購自美國Matrx有限公司；QIAamp DNA Stool Mini kit，購自QIAGIN公司；Illumina Miseq高通量測序平臺，購自美國Illumina公司。

2 方法

2.1 Balb/c小鼠原位結腸癌移植瘤模型

取對數生長期的CT26.WT結腸癌細胞，以1×106個細胞0.1 ml注射于2只Balb/c小鼠右側腋下。21 d后，將2只小鼠處死后剝取瘤體，在0.9%氯化鈉溶液中切成1×1×1 mm的瘤塊。經氣體麻醉后，用約50ul組織膠水將瘤塊種植于距盲腸2～3 cm的結腸上，避免穿孔和黏連，共種植12只Balb/c小鼠。

2.2 分組及給藥

種瘤后第2天將12只Balb/c小鼠分為2組，每組6只?；熃M腹腔注射奧沙利鉑5 mg/kg，隔日1次[7]，腹腔注射5-氟尿嘧啶25 mg/kg，隔日1次。如第1天給予5-FU則第2天給予L-OHP，循環(huán)7次?；熉?lián)合中藥組在化療組的基礎上每天灌胃給予健脾固腸方顆粒劑14.43 g/kg，健脾固腸方顆粒劑共給予14次。

2.3 取材

給藥14 d后脫頸處死12只小鼠，取出盲腸內容物置于-80 ℃冰箱待檢。距離盲腸約3 cm取小腸組織，將其切成厚度約0.2～0.3 cm，大小為1.5×1.5×0.3 cm的組織塊，置于4%中性甲醛中固定24～48 h。

2.4 檢測

2.4.1 病理檢測 將固定后的組織使用流水進行清洗，分別使用不同濃度梯度的乙醇進行脫水，使用二甲苯進行透明處理，將組織進行石蠟包埋，使用切片機將其切成4～7 μm薄片，使用二甲苯進行脫蠟，隨后使用不同濃度梯度的乙醇進行水化，使用蘇木素、伊紅進行染色并顯微鏡下觀察。小腸腸黏膜損傷程度的判斷方式根據Chiu氏6級法進行評分：正常的腸黏膜絨毛評為0級，小腸絨毛頂端上皮下隙出現(xiàn)增大評為1級，上皮層和固有層出現(xiàn)中度分離評為2級，絨毛兩側出現(xiàn)大量分離伴隨部分絨毛頂端破損評為3級，絨毛出現(xiàn)破損并伴固有層毛細血管暴露評為4級，固有層出現(xiàn)破壞、出血及潰瘍評為5級。

2.4.2 菌群的檢測和分析 室溫融化糞便樣品，準確稱取200 mg樣本，將其置于1.5 ml EP管中，加入1 ml PH=7.4 PBS緩沖液，充分渦旋震蕩，13000 r/min離心2 min，去上清后收集沉淀，如上反復2次操作后將沉淀溶于TE溶液中。QIAamp DNA Stool Mini kit試劑盒提取過程嚴格按照試劑盒說明書。以上述提取的DNA作為模板進行16S rRNA 的PCR擴增。擴增所需條件：98℃30 s預變形，98℃10 s，50℃30 s，72℃30 s，重復20個循環(huán)；最后以72℃7 min延伸，產物保存在4 ℃冰箱，并將產物置于Illumina Miseq進行高通量測序。

使用生物信息學方法進行分析，該方法主要是基于OTU進行的分析，Simpson指數主要用來估算樣品中微生物多樣性的指標，Simpson指數越高表明微生物多樣性程度越高。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 使用Chiu氏6級評分結果

圖1表1示，化療組與化療聯(lián)合中藥組比較發(fā)現(xiàn)，化療聯(lián)合中藥組腸道損傷更低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.044)。化療組有2例出現(xiàn)絨毛破損并伴固有層毛細血管暴露(4級)，2例3級和2例2級；而化療聯(lián)合中藥組損傷程度更輕，3例僅出現(xiàn)上皮層和固有層中度分離(2級)，1例3級和2例1級。

表1 化療組與化療聯(lián)合中藥組腸黏膜損傷程度比較

圖1 化療組與化療聯(lián)合中藥組腸黏膜損傷程度比較

3.2 2組菌群多樣性比較

圖2示，化療組與化療聯(lián)合中藥組Simpson指數比較，化療聯(lián)合中藥組Simpson指數更高，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.029)。

3.3 菌屬差異比較

圖3示，化療組與化療聯(lián)合中藥組比較，發(fā)現(xiàn)化療聯(lián)合中藥組中的梭菌屬(Clostridium)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、變形桿菌屬(Proteobacteria)等菌屬明顯增多，且與化療組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，P=0.001，P<0.01，P<0.01)。

圖2 化療組與化療聯(lián)合中藥組多樣性比較

圖3 化療組與化療聯(lián)合中藥組菌屬差異比較

3.4 代謝通路

圖4示，化療聯(lián)合中藥組與化療組比較，發(fā)現(xiàn)菌群毒素的代謝和脂肪酸的生物合成等通路差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.029、P=0.045)。

圖4 中藥可能的代謝通路

4 討論

據報道，化療所導致的胃腸道毒副反應發(fā)生率達到70%～95%[7]?；煵粌H會嚴重損傷化療敏感組織，還會誘發(fā)腸道炎癥反應的發(fā)生，破壞腸道菌群的平衡和腸道屏障的完整等，引起二胺氧化酶、D-乳酸水平的升高。前期臨床試驗證明，健脾固腸方能降低化療后二胺氧化酶、D-乳酸水平，二胺氧化酶能夠反映腸黏膜細胞的完整性，D-乳酸能夠體現(xiàn)腸黏膜損傷程度。腸黏膜嚴重損傷時可發(fā)生患者脫水、水電解質紊亂甚至出現(xiàn)死亡。化療所導致的腸黏膜損傷會干擾化療的進程，導致化療劑量的減少和強度的減低，甚至是停藥情況的發(fā)生，進而導致患者的預后變差[8]，健脾固腸方能夠下調兩者的水平，本次實驗通過病理結果證明其能夠緩解腸黏膜損傷程度。

現(xiàn)代醫(yī)學證實，腸道的正常菌群起到促進消化吸收、刺激免疫力和防治疾病的作用。故我們認為，正常腸道菌群是中醫(yī)后天之本脾臟的物質基礎，是氣血生化的源頭[9]。健脾固腸方為鐘薏的自擬方，臨床用以治療化療所導致的腸道炎癥反應。該方以四君子湯作為底方，其中黨參具有補益脾胃之氣、益胃生津的作用?，F(xiàn)代研究表明，其具有抑制消化道潰瘍、保護腸道黏膜完整性和調整胃腸功能等作用，其可能的機理為增加腸道內乳酸桿菌的數量以及降低大腸桿菌的豐度[10]。黨參的有效成分為黨參炔苷、黨參多糖和毛果蕓香堿等[11]；白術具有補益脾胃之氣、利水化濕作用，現(xiàn)代研究表明其具有調節(jié)胃腸功能運動的作用[12]，其可能的機理為增加雙歧桿菌和乳桿菌的數量以及降低腸桿菌的豐度[13]。白術的有效成分為白術揮發(fā)油、白術多糖等[14]；茯苓具有健脾利水化濕的作用，現(xiàn)代研究表明其具有緩解腸道微循環(huán)障礙的作用[15]，其可能的機理為升高雙歧桿菌水平[11]，茯苓的有效成分為茯苓酸、茯苓總三萜等[16-17]；甘草具有補益脾胃之氣、清熱解毒作用，現(xiàn)代研究表明具有促進腸道黏膜愈合、抑制腸道炎癥反應等作用[18]，其可能的機理為改變腸道菌群結構[19]，甘草的有效成分為甘草三萜皂苷類、甘草黃酮類等。

化療藥物會打破腸道的菌群狀態(tài)，表現(xiàn)為菌群的失調和共生菌數量的減少，進而導致腸道黏膜的損傷和炎癥的發(fā)生[20-21]。主流觀點認為，菌群結構的調節(jié)尤其是補充短鏈脂肪酸產生菌的豐度能夠治療消化道疾病。2018年上海交通大學趙立平篩選出普拉梭菌屬、毛螺旋菌屬、真桿菌屬、瘤胃球菌屬、梭菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、變形桿菌屬為短鏈脂肪酸產生菌，并明確了其中的15個株型[22]。健脾固腸方能增加化療后的菌群多樣性，提高梭菌屬、毛螺菌屬、雙歧桿菌屬、變形桿菌屬等豐度，而這幾種菌屬均為短鏈脂肪酸產生菌。而之后通過菌群結果推測的代謝通路結果同樣提示，健脾固腸方能夠加速菌群毒素的排泄，加快脂肪酸的生物合成。故推測健脾固腸方可能通過提高短鏈脂肪酸產生菌的豐度，進而加速菌群毒素的排泄和加快脂肪酸的生物合成，最終緩解腸道炎癥反應。

綜上所述，健脾固腸方能減輕腸癌小鼠化療后腸道炎癥反應,其機制可能是通過提高短鏈脂肪酸產生菌的豐度, 進而加速菌群毒素的排泄和加快脂肪酸的生物合成，最終緩解腸道炎癥反應。