日本結(jié)縷草修剪后防御響應(yīng)的分子機(jī)制

何旭升， 徐志高， 劉敏杰

(國(guó)家林業(yè)和草原局中南調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院，長(zhǎng)沙 410014)

機(jī)械損傷脅迫諸如修剪、踐踏等在自然界中普遍存在，也是植物在其生命周期中不可避免的一種非生物脅迫。為了應(yīng)對(duì)這樣的脅迫環(huán)境，植物已經(jīng)進(jìn)化出了一套完整的應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制，來(lái)抵御受創(chuàng)傷后的一系列不利因素。目前植物應(yīng)對(duì)機(jī)械損傷脅迫防御響應(yīng)機(jī)制的研究主要在擬南芥(Arabidopsisthaliala(L.) Heynh)等模式植物中進(jìn)行[1]。研究發(fā)現(xiàn)，植物創(chuàng)傷傷口的周?chē)鷷?huì)產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive Oxygen，ROS)類(lèi)物質(zhì)[2]，這些ROS類(lèi)物質(zhì)能夠與植物激素相互作用，從而影響下游的防御信號(hào)因子來(lái)調(diào)控相應(yīng)的防御響應(yīng)[3]?，F(xiàn)有研究表明，ROS能夠通過(guò)促進(jìn)重要的防御類(lèi)植物激素脫落酸(ABA)的生物合成，以及抑制ABA的降解，使得植物內(nèi)源ABA水平升高。而ABA又能促進(jìn)植物保衛(wèi)細(xì)胞產(chǎn)生ROS類(lèi)物質(zhì)，因此植物在受到機(jī)械損傷脅迫后會(huì)產(chǎn)生ROS類(lèi)物質(zhì)和植物激素ABA之間的正反饋調(diào)節(jié)，從而介導(dǎo)植物氣孔的關(guān)閉，增強(qiáng)植物的防御[4-5]。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)ABA能夠通過(guò)促進(jìn)另一種重要防御類(lèi)植物激素茉莉酸(JA)的生物合成來(lái)激活植物防御響應(yīng)[6]。

植物激素JA是公認(rèn)的植物應(yīng)對(duì)機(jī)械損傷脅迫重要的信號(hào)物質(zhì)， 植物創(chuàng)傷會(huì)導(dǎo)致植物內(nèi)源JA水平的升高，從而促進(jìn)防御反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，以此激活植物的防御響應(yīng)[7]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)番茄葉片受到機(jī)械損傷時(shí)，其內(nèi)源JA水平升高，同時(shí)JA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因和下游的防御基因也在數(shù)小時(shí)內(nèi)被激活[8-9]。另外，JA以及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也是植物抵御昆蟲(chóng)或食草類(lèi)動(dòng)物所必須的，而具有JA合成缺陷或?qū)A信號(hào)有感知缺陷的擬南芥突變體，更易遭受昆蟲(chóng)的襲擊[10-11]。最新的研究表明，JA還可以抑制植物生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制參與植物生長(zhǎng)和代謝(光合作用)相關(guān)酶的合成，使植物可以將更多的資源用于防御響應(yīng)[12]。因此，植物激素ABA和JA在植物應(yīng)對(duì)機(jī)械損傷脅迫的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

日本結(jié)縷草(Zoysiajaponica)是禾本科多年生暖季型草坪草，因具有優(yōu)良的耐修剪和踐踏的特性，廣泛應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)場(chǎng)草坪和園林綠化。日本結(jié)縷草這個(gè)特性也使它成為研究禾本科草地植物修剪后防御響應(yīng)機(jī)制的理想材料，但是目前對(duì)其這一方向的研究還很少。為了探究日本結(jié)縷草修剪后防御響應(yīng)的分子機(jī)制，本研究對(duì)日本結(jié)縷草品種“Zenith”在修剪后0，2，6 h和24 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，創(chuàng)傷葉片的過(guò)氧化氫(H2O2)含量及細(xì)胞膜透性進(jìn)行檢測(cè)，以探究其葉片創(chuàng)傷程度隨時(shí)間的變化。同時(shí)通過(guò)對(duì)內(nèi)源JA和ABA水平的檢測(cè)，以及這兩種植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑四個(gè)關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)，來(lái)探究JA和ABA對(duì)修剪后日本結(jié)縷草防御響應(yīng)的影響。為提高禾本科草地植物的耐修剪和抗踐踏性能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1)植物材料。日本結(jié)縷草(Zoysia japonica)品種“Zenith”，由美國(guó)Hancock種子公司(Hancock Seed Inc)提供。盆栽種植于室內(nèi)，所用基質(zhì)為泥炭∶蛭石∶砂=2∶2∶1，溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%。將生長(zhǎng)至兩個(gè)月的未分蘗植株用剪刀修剪至4 cm高，分別在修剪后的0，2，6 h和24 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣(0為剛修剪完取樣，作為對(duì)照)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)三次重復(fù)，取樣部位為葉片部分，所取樣品立即用液氮速凍處理后放-80 ℃保存。

2)試劑。Eastep Super總RNA提取試劑盒(Invitrogen，China)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega， USA)，熒光定量試劑購(gòu)自北京全式金公司的TranScriptⅡ Green one-Step qRT-PCR SuperMix、Tip Green Qpcr SuperMix。

3)儀器 。NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，USA)，PCR儀(Biometra，German)，ABI stepone實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI，USA)。

1.2 方法

1.2.1 過(guò)氧化氫水平和細(xì)胞膜通透性的測(cè)定

利用3，3'-二氨基聯(lián)苯胺染色法(DAB染色法)測(cè)定葉片傷口處的過(guò)氧化氫含量，每個(gè)圖片代表了超過(guò)10個(gè)樣品在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)(修剪后0， 2， 6h和24 h)的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中的染色情況。

參考王學(xué)奎的方法對(duì)葉片進(jìn)行相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定[13]，以此來(lái)檢測(cè)受傷葉片的細(xì)胞膜透性。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3次重復(fù)。

1.2.2 植物激素水平測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)分別測(cè)定修剪后日本結(jié)縷草葉片內(nèi)源ABA和JA的含量。具體操作步驟參考ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)的計(jì)算公式以及稀釋倍數(shù)可計(jì)算出植物激素水平。

1.2.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

取50～100 mg冷凍樣品用液氮研磨，隨后依照Eastep Super總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行RNA的提取。得到的樣品RNA經(jīng)由經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)測(cè)其濃度及OD260/OD280。最后采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄方法參照試劑盒操作方法，得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)Actin[14]檢測(cè)后稀釋至200 ng/μL[15]。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)

從已發(fā)表的日本結(jié)縷草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[16]中獲得ZjCOI1、ZjMYC2、ZjPP2C和ZjSNRK2四個(gè)基因的保守序列，然后用primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

ZjCOI1基因引物序列為：上游引物5' ATCTTACTCCTGCCCTTTGGAAACA 3'，下游引物5' GCTGTAGCGGAGGTGTAGTGAAATA 3'；

ZjMYC2基因引物序列為：上游引物5' ATGCAATGCGTGCTTAATCATACT 3'，下游引物5' CGATACCGTTACTCTTACCCACCT 3'；

ZjPP2C基因引物序列為：上游引物5' TTGTCACTGGCTGTTCACCAAACC 3'，下游引物5' TGTGATGTAGCACGCAAACGGATA 3'；

ZjSNRK2基因引物序列為：上游引物5' CGTATCTTTGTTGCCAATCCTGC 3'，下游引物5' TTATCGTATTCACCTTCCTCGTT 3'。

1.2.5 普通PCR

利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系50 μL，一次加入Tag酶Mix 5 μL，上下游引物各1 μL，樣品RNA 1 μL，去離子水2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35次循環(huán)；最后72℃延伸5 min，12 ℃保溫。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

采用ABI stepone 熒光定量PCR儀進(jìn)行進(jìn)行基因的相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)，參照北京全式金公司的試劑盒TranScriptⅡ Green one-Step qRT-PCR SuperMix的操作步驟進(jìn)行上機(jī)反應(yīng)。每個(gè)樣品4個(gè)重復(fù)，結(jié)果采用2-△△CT算法進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的量化分析[17]。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft Office Excel 2003與SPSS V19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及差異性分析。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)傷葉片過(guò)氧化氫含量和細(xì)胞膜透性

機(jī)械損傷會(huì)破壞植物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致活性氧類(lèi)物質(zhì)過(guò)氧化氫(H2O2)在傷口處聚集[18]。通過(guò)對(duì)修剪后的日本結(jié)縷草葉片進(jìn)行DAB染色和相對(duì)電導(dǎo)率(EL)的檢測(cè)，來(lái)判定傷口處的H2O2含量和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，H2O2在創(chuàng)傷部位迅速的積累(圖1)。修剪后的0， 2， 6 h和24 h的創(chuàng)傷葉片中，0時(shí)點(diǎn)(圖1A)的染色程度最高，在2 h(圖1B)下降，在6 h和24 h(圖1C和1D)的H2O2染色水平最低，表明創(chuàng)傷葉片的H2O2水平在修剪后爆發(fā)然后逐漸下降。細(xì)胞膜透性的試驗(yàn)結(jié)果顯示，0時(shí)點(diǎn)創(chuàng)傷葉片的細(xì)胞膜透性顯著高于其它三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(P<0.05，圖2)，這表明細(xì)胞在修剪后的0時(shí)點(diǎn)損傷最嚴(yán)重；在2 h時(shí)，EL明顯下降，但仍高于6 h和24 h的水平(P>0.05)；而6 h和24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的EL水平無(wú)顯著差異(P>0.05)。細(xì)胞膜透性的結(jié)果與DAB染色結(jié)果一致，呈先爆發(fā)后下降至平穩(wěn)的趨勢(shì)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，修剪后的創(chuàng)傷葉片細(xì)胞在0時(shí)點(diǎn)受傷最為嚴(yán)重，在修剪后的6 h內(nèi)逐漸恢復(fù)，24 h無(wú)明顯變化。

圖1 創(chuàng)傷葉片的DAB染色

圖2 創(chuàng)傷葉片的相對(duì)電導(dǎo)率(EL)注：***指 P<0.001

2.2 創(chuàng)傷葉片內(nèi)源JA和ABA水平

植物應(yīng)對(duì)機(jī)械損傷脅迫的防御響應(yīng)受到多種因素的影響，植物激素在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，機(jī)械損傷會(huì)導(dǎo)致植物的JA和ABA水平顯著的變化[19-20]。

因此，本研究對(duì)修剪后日本結(jié)縷草葉片中的JA和ABA含量進(jìn)行了檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果如圖3。修剪后葉片的JA含量沒(méi)有顯著變化(P>0.05)(圖3A)。但是ABA的水平隨著時(shí)間的推移發(fā)生了顯著的變化，在修剪后2 h和24 h 的ABA水平要顯著高于修剪后6 h的ABA水平(P<0.05)(圖3B)，0時(shí)點(diǎn)和其他時(shí)間點(diǎn)的ABA水平?jīng)]有顯著差異(P>0.05)。表明，兩種植物激素在修剪后日本結(jié)縷草葉片中表現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，JA變化相對(duì)平穩(wěn)，而ABA水平在0～24h內(nèi)呈動(dòng)態(tài)變化。

圖3 修剪后日本結(jié)縷草葉片的JA和ABA水平注：*指P<0.05， **指P<0.01。

2.3 創(chuàng)傷葉片JA和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因相對(duì)表達(dá)量情況

為了進(jìn)一步探究植物激素JA和ABA在修剪后日本結(jié)縷草防御響應(yīng)中的作用，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分別測(cè)量了修剪后0， 2， 6 h和24 h的JA和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖4。

圖4 損傷過(guò)程中激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)注：*指P<0.05， **指P<0.01， ***指P<0.001。

COI1(Coronatine-insensitiveprotein1)是JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因，COI1能促進(jìn)信號(hào)因子MYC2的釋放，以此來(lái)激活JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，被釋放的轉(zhuǎn)錄因子MYC2進(jìn)而能夠調(diào)控下游防御基因的表達(dá)，使植物產(chǎn)生防御應(yīng)答[21-22]。在修剪后的日本結(jié)縷草葉片中，ZjCOI1基因和ZjMYC2基因在2， 6 h和24 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量都顯著上調(diào)(P<0.05)(圖4A)。

PP2C和ZjSNRK2是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中兩個(gè)關(guān)鍵基因，PP2C能夠通過(guò)去磷酸化作用來(lái)抑制ZjSNRK2，從而抑制ABA信號(hào)通路[23]。當(dāng)日本結(jié)縷草被修剪后，ZjPP2C在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著下調(diào)(P<0.05)，而ZjSNRK2在2 h和6 h時(shí)顯著上調(diào)(P<0.05)，但在24 h的表達(dá)水平與0時(shí)點(diǎn)無(wú)顯著區(qū)別(P>0.05)(圖4B)。表明，兩種與植物防御相關(guān)的植物激素JA和ABA的信號(hào)大多在2， 6 h和24 h激活。

3 討論

機(jī)械損傷脅迫會(huì)誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種防御響應(yīng)，其中ROS的爆發(fā)是最廣為人知的。ROS是植物在遭受脅迫后產(chǎn)生的一種特殊的物質(zhì)，能夠作為一種信號(hào)因子，傳遞脅迫信號(hào)從而引起系統(tǒng)的防御應(yīng)答[24]。本研究試驗(yàn)結(jié)果顯示，受傷的葉片在0時(shí)點(diǎn)的染色程度最高，在2 h時(shí)開(kāi)始下降，6 h和24 h時(shí)的染色水平達(dá)到最低，這樣的結(jié)果表明在修剪后的日本結(jié)縷草葉片中出現(xiàn)了ROS的爆發(fā)，隨后細(xì)胞又產(chǎn)生了ROS的消除反應(yīng)。

研究表明，ROS能夠促進(jìn)ABA的生物合成或抑制ABA降解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離ABA水平升高[5，25]。ABA是植物應(yīng)對(duì)外界脅迫的重要植物激素，主要參與植物的滲透調(diào)節(jié)、病害預(yù)防等[26]。還有一些研究表明，ABA介導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路能夠誘導(dǎo)CAT1(Catalase)基因的表達(dá)，從而抑制H2O2的水平[27]。從本研究ABA水平的變化中可以看出，日本結(jié)縷草創(chuàng)傷葉片的ABA水平在6 h時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但并沒(méi)有與創(chuàng)傷葉片的H2O2一樣呈現(xiàn)持續(xù)的下降，而是在24 h時(shí)又出現(xiàn)上升。據(jù)此推測(cè)在日本結(jié)縷草中也存在ROS爆發(fā)所誘導(dǎo)的ABA的生物合成過(guò)程以及ABA介導(dǎo)的H2O2抑制過(guò)程。同時(shí)，應(yīng)該還存在另外的機(jī)制來(lái)誘導(dǎo)葉片中已經(jīng)下降的ABA水平在24 h又重新上升。植物激素ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在受傷的日本結(jié)縷草中也起著重要的作用。qRT-PCR結(jié)果表明，ABA信號(hào)在6 h時(shí)更加活躍。研究表明，ABA可以通過(guò)胼胝質(zhì)的合成來(lái)提高植物防御[28]。結(jié)合本研究之前創(chuàng)傷葉片H2O2和細(xì)胞膜透性的結(jié)果，可知在修剪后的日本結(jié)縷草中也存在該防御過(guò)程。

植物激素JA在植物應(yīng)對(duì)機(jī)械損傷脅迫的過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和防御基因會(huì)在受到創(chuàng)傷后的幾小時(shí)內(nèi)被系統(tǒng)性的激活[8-9]。另外，JA以及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也是植物抵御昆蟲(chóng)或食草類(lèi)動(dòng)物所必須的[10-11]。本研究的試驗(yàn)結(jié)果表明，創(chuàng)傷葉片的內(nèi)源JA水平在6 h都保持較高水平；JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在6 h時(shí)更加活躍。這些結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致，因此可知在修剪后的日本結(jié)縷草中也存在JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與的抵御外界昆蟲(chóng)啃食的防御響應(yīng)。

綜上所述，JA和ABA通過(guò)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了日本結(jié)縷草修剪后的防御響應(yīng)，可能通過(guò)消除創(chuàng)傷葉片處的H2O2、修復(fù)創(chuàng)傷葉片傷口以及抵御食草昆蟲(chóng)侵襲等途徑來(lái)激活和增強(qiáng)植物的防御響應(yīng)。本文初步探究了日本結(jié)縷草修剪后防御響應(yīng)的分子機(jī)制，證明了植物激素JA和ABA在日本結(jié)縷草應(yīng)對(duì)機(jī)械損傷脅迫的防御響應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，為提高禾本科草地植物耐修剪和抗踐踏性能提供了理論基礎(chǔ)。