miR-223和miR-192在重癥肺炎患兒血清中的表達(dá)意義

孫卉芳 孫永法 王丹鳳

肺炎是兒童時(shí)期尤其是嬰幼兒時(shí)期最為常見(jiàn)的呼吸道感染性疾病。臨床根據(jù)病情嚴(yán)重程度，將肺炎分為輕癥肺炎和重癥肺炎，前者癥狀輕、無(wú)并發(fā)癥、預(yù)后好；后者起病急、變化快、病情重、并發(fā)癥多，?？晌＜皟和菍?dǎo)致5歲以下兒童死亡的主要原因[1-2]。在肺炎患兒中，有8%～14%屬于重癥肺炎。兒童重癥肺炎具有發(fā)病快、并發(fā)癥多，常累及全身、典型表現(xiàn)常被掩蓋或被忽略等特點(diǎn)，如果搶救時(shí)間倉(cāng)促極易導(dǎo)致診治不當(dāng)，會(huì)使病情進(jìn)展惡化，甚至死亡。因此，對(duì)兒童重癥肺炎的診斷和正確治療是兒科的重大課題[3-4]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類小分子非編碼的基因表達(dá)調(diào)控因子，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，它是一類高度保守、長(zhǎng)度很短的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，約20～24 nt。他們參與了許多生物過(guò)程，包括新陳代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和疾病控制，在心血管、呼吸、神經(jīng)和造血系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)內(nèi)都發(fā)揮作用，還報(bào)道了miRNA 參與紅細(xì)胞生成和血管生成。大量研究表明miRNA 與肺的生長(zhǎng)發(fā)育、肺炎、肺癌以及肺纖維化等肺部疾病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸有著密切的聯(lián)系[5-6]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-223 與miR-192在重癥肺炎患兒中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月至2019年1月本院收治的120例肺炎患兒為研究組，男性66例，女性54例，平均（3.56±1.20）歲。同時(shí)選取同期健康體檢兒童120例為對(duì)照組，其中男性60例，女性60例，平均（3.85±1.33）歲。根據(jù)重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)將研究組患兒分為輕度感染組、中度感染組與重度感染組，各40例[7]。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒家屬知情且簽署同意書(shū)。經(jīng)影像學(xué)檢查顯示患兒具有片狀浸潤(rùn)陰影、間質(zhì)性肺炎等炎性改變，自身有一定的免疫性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往窒息病史者；先天性心臟病、支氣管發(fā)育不良等先天性疾病者；合并吸入性肺炎、敗血癥等感染性疾病者；意識(shí)障礙等；家族性疾病患兒。對(duì)照組與研究組患兒性別、年齡等資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集

抽取各組患兒清晨空腹靜脈血5 mL，4℃條件下經(jīng)3 000 r/min 離心15 min，吸取上清至EP 管內(nèi)，置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)miR-223、miR-192 的表達(dá)水平

采用Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）法血清中的總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司）說(shuō)明書(shū)操作將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μL，正反向引物0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足體系至20 μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。miR-223、miR-192 以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table1 Primer sequences

1.2.3 檢測(cè)血清ApoE、CRP、PCT水平

采用免疫比濁法檢測(cè)血清載脂蛋白E（ApoE，apolipoproteinE）與C-反應(yīng)蛋白（CRP，C-reactive protein）的水平，檢測(cè)儀器日立HITACHI7180 與配套試劑購(gòu)自東莞市毅萬(wàn)光源有限公司；采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清降鈣素原（PCT，procalcitonin）的水平，mini-VIDAS 免疫分析儀及其配套試劑購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃股份有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 法分析重癥肺炎患兒血清miR-223、miR-192 相關(guān)性及其兩者表達(dá)與ApoE、CRP、PCT水平的相關(guān)性；受試者工作特征（ROC，receiver operating characteristic）曲線分析血清miR-223、miR-192 對(duì)重癥肺炎的診斷價(jià)值。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-223 與miR-192 的表達(dá)水平和ApoE、CRP、PCT水平比較

與對(duì)照組相比，研究組血清miR-223 的表達(dá)水平顯著升高，血清miR-192 的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，研究組血清ApoE、CRP、PCT水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組血清miR-223、miR-192 的表達(dá)水平和ApoE、CRP、PCT水平比較（±ss）Table2 Comparison of the expression levels of serum miR-223 and miR-192 and the levels of ApoE，CRP and PCT between the 2 groups（±s）

表2 兩組血清miR-223、miR-192 的表達(dá)水平和ApoE、CRP、PCT水平比較（±ss）Table2 Comparison of the expression levels of serum miR-223 and miR-192 and the levels of ApoE，CRP and PCT between the 2 groups（±s）

組別對(duì)照組研究組t值P值n 120 120 miR-223 1.68±0.30 2.27±0.38 27.391 0.000 miR-192 0.90±0.25 0.45±0.30 20.651 0.000 ApoE（mg/dL）2.33±0.47 5.98±0.96 13.951 0.000 CRP（mg/L）5.21±1.89 10.35±2.67 13.695 0.000 PCT（ng/mL）0.15±0.03 0.37±0.10 15.632 0.000

2.2 不同感染程度患兒血清miR-223 與miR-192的表達(dá)水平比較

與輕度感染組相比，中度感染組與重度感染組血清miR-223 的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），血清miR-192 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.3 重癥肺炎患兒血清miR-223與miR-192相關(guān)性

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，重癥肺炎患兒血清中miR-223 與miR-192表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.226，P＜0.001）。見(jiàn)圖1。

2.4 重癥肺炎患兒血清miR-223 與miR-192 與ApoE、CRP、PCT 的相關(guān)性分析

采用Pearson 法結(jié)果顯示miR-223 與ApoE、CRP、PCT 呈正相關(guān)（P＜0.05），miR-192 與ApoE、CRP、PCT 呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表3 不同感染程度血清miR-223 與miR-192 的表達(dá)水平比較（±s）Table3 Expression levels of serum miR-223 and miR-192 at different infection levels（±s）

表3 不同感染程度血清miR-223 與miR-192 的表達(dá)水平比較（±s）Table3 Expression levels of serum miR-223 and miR-192 at different infection levels（±s）

注：與輕度感染組相比，aP＜0.05。

組別輕度感染組中度感染組重度感染組F值P值n 40 40 40 miR-223 1.91±0.32 3.21±0.56a 3.69±0.45a 25.669 0.000 miR-192 0.85±0.29 0.45±0.21a 0.40±0.25a 30.587 0.000

表4 肺炎患兒血清miR-223、miR-192 與ApoE、CRP、PCT的相關(guān)性分析Table4 Correlation analysis of serum miR-223，miR-192 and ApoE，CRP，PCT in children with pneumonia

2.5 血清miR-223 與miR-192 對(duì)重癥肺炎的診斷價(jià)值

ROC 分析血清miR-223、miR-192 以及兩個(gè)基因聯(lián)合對(duì)重癥肺炎的診斷價(jià)值。miR-223、miR-192 診斷重癥肺炎時(shí)的敏感度、特異度、AUC 面積、Z值，尤登指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)誤值等，見(jiàn)表5。

表5 血清miR-223與miR-192對(duì)重癥肺炎的診斷價(jià)值Table5 Diagnostic value of serum miR-223 and miR-192 in severe pneumonia

3 討論

重癥肺炎是一種呼吸系統(tǒng)急危重疾病，發(fā)展迅速、病情兇險(xiǎn)，應(yīng)快速采取針對(duì)性措施進(jìn)行綜合治療以改善患兒預(yù)后。重癥肺炎表現(xiàn)為肺部癥狀呼吸衰竭，還有全身中毒癥狀，其他臟器功能不全甚至衰竭，即常見(jiàn)的膿毒血癥。膿毒癥的感染灶分布于全身各處，臨床常見(jiàn)于肺部、腹膜、膽道系統(tǒng)、泌尿生殖系及腦膜炎等，皮膚膿腫也可引起膿毒癥，常常表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)綜合征。重癥肺炎可導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生，而膿毒癥也最常累及肺部，是引起呼吸衰竭最常見(jiàn)的原因，兩者互相影響。膿毒癥也是重癥肺炎患兒的主要死亡原因之一[8-9]。醫(yī)院獲得性肺炎是重癥患兒高死亡率的重要原因之一，其死亡率大約在33%～50%[10]，其主要病原菌是銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌，如若推遲抗感染治療時(shí)間，死亡率將增加至60%[11-12]。

miRNA 在細(xì)胞分化，生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮巨大作用，越來(lái)越多的引起研究人員的關(guān)注。隨著對(duì)于miRNA 作用機(jī)理的進(jìn)一步的深入研究，以及利用最新的技術(shù)miRNA 芯片等高通量的技術(shù)手段對(duì)于miRNA和疾病之間的關(guān)系進(jìn)行研究，將會(huì)使人們對(duì)于高等真核生物基因表達(dá)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)理解提高到一個(gè)新的水平。顏保松等[13]研究表明，miR-223 可作為肺結(jié)核潛在的有診斷價(jià)值的標(biāo)記物。柳新勝等[14]研究表明，miR-192 可以評(píng)估相關(guān)性肺炎患兒病情嚴(yán)重程度。

綜上所述，重癥肺炎患兒血清miR-223表達(dá)水平升高，miR-192的表達(dá)水平降低，且與肺炎嚴(yán)重程度有關(guān)，并可能作為早期診斷重癥肺炎的分子標(biāo)志物，臨床中對(duì)重癥肺炎患兒應(yīng)給予早期有效診斷，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹委?，可有效提高臨床療效。