維生素E 分子印跡聚合物的二步溶脹法制備

朱胤霈，盧軼男，印建國(guó)，張佑紅*，田 莉

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.江蘇璽鑫維生素有限公司，江蘇 宿遷 223600

維生素E（vitamin E，VE）能促進(jìn)性激素的分泌，預(yù)防流產(chǎn)，提高人體生育能力，市場(chǎng)價(jià)值潛力巨大［1］。目前我國(guó)提取的天然VE 主要來(lái)自脫臭餾出物［2］，由于脫臭餾出物中含有游離脂肪酸、甾醇等雜質(zhì)，提取VE 往往需要萃取、酯化、轉(zhuǎn)酯化、皂化等工藝的綜合運(yùn)用，但這些工藝都存在溶劑成本高、資源能耗大、VE 純度及收率低等問(wèn)題［3］。因此期望尋找一種高效的分離提純VE 的工藝過(guò)程，能夠簡(jiǎn)化生產(chǎn)流程，降低成本。分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）作用精準(zhǔn)，能從復(fù)雜混合物中直接吸附待分離的目標(biāo)物［3-6］，具有優(yōu)異的選擇吸附性。在藥物手性拆分、模擬酶催化、生物傳感器等方面有很好的發(fā)展和應(yīng)用［7-10］。本文選取二步溶脹聚合法［11-13］，用聚苯乙烯微球作為VE 分子印跡聚合物的種球，成功合成印跡聚合物，并從吸附機(jī)理、吸附行為等方面對(duì)該聚合物進(jìn)行分析研究。此研究為應(yīng)用印跡聚合物提純VE的工藝提供了一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 化學(xué)試劑與材料

1.1.1 主要化學(xué)試劑 VE（純度：94.02%），苯乙烯，甲基丙烯酸，正辛醇，乙二醇二甲基丙烯酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，偶氮二異丁腈，十二烷基硫酸鈉，聚乙烯醇，鄰苯二甲酸二丁酯，甲苯，三氯甲烷等試劑均為分析純。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，上海亞榮生化儀器廠）；高效液相色譜儀（Agilent1260，安捷倫科技有限公司）；索式提取器（SXT-06，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（HZQ-X100，金壇市杰瑞爾電器）；超聲波細(xì)胞粉碎儀（JY92-2D，寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑前處理 苯乙烯：在分液漏斗中倒入50 mL 苯乙烯，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的氫氧化鈉萃取3次（去除阻聚劑對(duì)苯二酚），再用超純水反復(fù)洗滌至流出液呈中性后，將其減壓蒸餾得到精制產(chǎn)物，低溫保存。

二甲基丙烯酸乙二醇酯：處理方法與苯乙烯單體相同。

偶氮二異丁腈：取4 g 偶氮二異丁腈，加入到30 mL 乙醇中并于65 ℃加熱溶解，過(guò)濾后將濾液放于冰箱內(nèi)結(jié)晶24 h，所得固體放入棕色瓶?jī)?nèi)低溫保存。

1.2.2 聚合物微球的合成 準(zhǔn)確量取50 mL 乙醇和50 mL 苯乙烯于150 mL 的錐形瓶中，分別加入0.2 g 偶氮二異丁腈，1 g 聚乙烯吡咯烷酮，冰浴超聲10 min，然后將溶液倒入圓底燒瓶中，升溫70 ℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，過(guò)濾除去液體干燥備用。

1.2.3 聚合物的合成 1）印跡聚合物的合成：稱(chēng)取1 g 聚苯乙烯微球，0.2 g 十二烷基硫酸鈉，30 mL超純水，于400 W 超聲15 min（室溫，超聲5 s/間隔5 s，以下實(shí)驗(yàn)步驟超聲條件相同），稱(chēng)取0.5 mL 鄰苯二甲酸二丁酯，0.1 g 偶氮二異丁腈，1 mL 甲苯，30 mL 超純水，于150 W 超聲5 min，將兩混合溶液倒入一個(gè)圓底燒瓶?jī)?nèi)，室溫下150 r/min 攪拌24 h。取0.43 g VE，0.1 g 十二烷基硫酸鈉，3.96 g 二甲基丙烯酸乙二醇酯（ethyleneglycol dimethacrylate，EGDMA），0.52 g 甲 基 丙 烯 酸（methacrylic acid，MAA），0.4 g 聚乙烯醇，5 mL 正辛醇，10 mL 氯仿，40 mL 超純水，于400 W 超聲15 min，加入上述圓底燒瓶中繼續(xù)攪拌24 h。稱(chēng)取0.2 g 聚乙烯醇，20 mL 超純水，于400 W 超聲10 min，加入上述圓底燒瓶中，升溫70 ℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)24 h。將反應(yīng)結(jié)束后得到的固體顆粒置于索氏提取器中，用甲醇-乙酸溶液（V甲醇∶V乙酸=9∶1）洗滌24 h，再用純甲醇溶液沖洗5 h，干燥后即得VE MIPs。

2）非印跡聚合物的合成：除不加入VE 外，其他步驟與上述內(nèi)容相同。

1.3 分子印跡聚合分析與表征

用掃描電子顯微鏡觀察MIPs 的表觀形貌是否為球形，表面是否有孔穴；用傅里葉紅外光譜儀分別測(cè)定功能單體MAA、交聯(lián)劑EGDMA 及VE MIPs的紅外吸收譜帶，分析功能單體是否與交聯(lián)劑聚合，印跡聚合物是否具有能與VE 特異性結(jié)合的官能團(tuán)。

1.4 VE 的HPLC 定量方 法

采用液相色譜法來(lái)檢測(cè)VE 的含量，檢測(cè)條件如下：流動(dòng)相為甲醇-水溶液（V甲醇∶V水=99∶1）；流速為1 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；色譜柱為C18 色譜柱（4.6 mm×100 mm，5 μm）；柱溫為20 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為UV-294 nm。

用甲醇配制濃度梯度為1 mmol/L 的VE 溶液（濃度范圍為1～5 mmol/L），采用外標(biāo)法，繪制VE濃度-峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.5 VE 分子印跡聚合物靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

配制初始濃度在0.3 mmol/L 至1.8 mmol/L 之間的VE 氯仿溶液各10 mol，將其分別加入含有50 mg 分子印跡聚合物的錐形瓶中。密封置于25 ℃恒溫振蕩箱，振蕩吸附120 min 以上。吸附結(jié)束后，混合物用0.45 μm 的有機(jī)相微膜過(guò)濾，再取濾液1 mL 于干燥箱內(nèi)抽干除去氯仿，所得干燥樣品再用1 mL HPLC 甲醇溶解，用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)并計(jì)算印跡聚合物的吸附量：

式中，Qe—印跡聚合物對(duì)VE 的吸附達(dá)到平衡時(shí)的吸附量（μmol/g）；Ce—（mmol/L）；V—印跡聚合物對(duì)VE 的吸附達(dá)到平衡時(shí)的體積（mL）；C0—未進(jìn)行吸附時(shí)VE 的濃度（mmol/L）；m—吸附劑印跡聚合物的質(zhì)量（g）。

作為對(duì)照，在測(cè)定分子印跡聚合物吸附等溫線(xiàn)的同時(shí)也對(duì)非印跡聚合物的吸附等溫線(xiàn)進(jìn)行了測(cè)定，其方法與上述相同。

1.6 分子印跡聚合物吸附機(jī)理分析

為從吸附機(jī)理上更好地理解分子印跡聚合物吸附VE 的過(guò)程，分子印跡聚合物的吸附行為選用Langmuir 吸 附 模 型［14］與Freundlich 吸 附 模 型［15］來(lái)進(jìn)行分析，印跡聚合物與VE 結(jié)合特性的分析選用Scatchard 模型來(lái)進(jìn)行。

Langmuir 方程式為：

式中：c—印跡聚合物對(duì)VE 的吸附達(dá)到平衡時(shí)的濃度（mg/L）；q—印跡聚合物對(duì)VE 的吸附達(dá)到平衡時(shí)的吸附量（mg/g）；qe—印跡聚合物對(duì)VE的飽和吸附量（mg/g）；b—吸附平衡常數(shù)。

Freundlich 方程：

式中：q—印跡聚合物對(duì)VE 的吸附達(dá)到平衡時(shí)的吸附量（mg/g）；c—印跡聚合物對(duì)VE 的吸附達(dá)到平衡時(shí)的濃度（mg/L）；k 與n—特征常數(shù)。濃度對(duì)吸附能力的影響用1/n 來(lái)表示，當(dāng)0.1＜1/n＜0.5時(shí)，吸附質(zhì)容易被吸附；當(dāng)1/n＞2 時(shí)，吸附質(zhì)不易被吸附［14］。

Scatchard 模型［16］為：

式中，C—印跡聚合物對(duì)VE 的吸附達(dá)到平衡時(shí)的濃度（mmol/L）；Q—印跡聚合物對(duì)VE 的吸附達(dá)到平衡時(shí)的吸附量（μmol/g）；Qmax—印跡聚合物對(duì)VE 的最大表觀吸附量（μmol/g）；Kd—平衡解離常數(shù)（mmol/L）。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物的表觀形貌

由圖1 可知，二步溶脹法制得的分子印跡聚合物微球呈現(xiàn)均勻球形，外形規(guī)則、無(wú)破損，其表面存在一定的孔穴，為后續(xù)的靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)提供了良好的基礎(chǔ)。

圖1 分子印跡聚合物的掃描電鏡圖：（a）聚合物微球，（b）微球表面Fig.1 SEM images of MIPs：（a）polymer microsphere，（b）surface of the micropshere

2.2 分子印跡聚合物的紅外分析

圖2 中的a、b 及c 曲線(xiàn)分別是功能單體MAA、交聯(lián)劑EGDMA 及MIPs 的紅外吸收光譜圖。在交聯(lián)劑c 曲線(xiàn)紅外譜圖（Infrared Spectroscopy，IR）中可以看出，在3 400 cm-1處的吸收峰是羥基的伸縮振動(dòng)峰，在1 720 cm-1處的吸收峰是羰基的伸縮振動(dòng)峰，這兩類(lèi)峰的出現(xiàn)表明由聚合作用得到的聚合物中已經(jīng)引入了可以同模板分子作用的羥基和羰基基團(tuán)。1 637 cm-1附近的碳碳雙鍵峰值較弱，且在1 150 cm-1處出現(xiàn)了碳氧鍵的伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明絕大多數(shù)的功能單體MAA 和交聯(lián)劑EGDMA 已經(jīng)進(jìn)行交聯(lián)聚合成功，僅剩部分殘余未聚合。

圖2 （a）MAA，（b）EGDMA，（c）MIPs 的紅外光譜圖Fig.2 IR spectra of（a）MAA，（b）EGDMA and（c）MIPs

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

由圖3 可知，在所測(cè)量的范圍VE 濃度與峰面積有良好的線(xiàn)性關(guān)系，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可以通過(guò)色譜檢測(cè)得到的峰面積數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算靜態(tài)吸附溶液中VE 濃度的具體數(shù)值。

圖3 VE 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.3 Standard curve of VE

2.4 吸附等溫線(xiàn)

吸附等溫線(xiàn)研究的是分子印跡聚合物吸附容量隨VE 平衡濃度的變化情況，以吸附到達(dá)平衡時(shí)VE 的濃度為橫坐標(biāo)，以吸附劑的平衡吸附量為縱坐標(biāo)作圖可得吸附等溫線(xiàn)，如圖4 所示。當(dāng)VE 初始濃度逐漸增大時(shí)，在印跡聚合物中VE 的吸附量持續(xù)增加，而非印跡聚合物對(duì)VE 的吸附量很低且很快到達(dá)平衡。這是由于功能單體與VE 通過(guò)氫鍵作用力形成了具有特定空間結(jié)構(gòu)的孔穴及相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，這令分子印跡聚合物與VE 之間產(chǎn)生了較高的親和力，而非印跡聚合物與模板分子維生素E 的結(jié)合主要是通過(guò)無(wú)規(guī)律的物理吸附作用力，沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，吸附能力較差。

圖4 分子印跡聚合物和非印跡聚合物對(duì)VE 的吸附等溫線(xiàn)Fig.4 Adsorption isotherms of MIPs and NIPs towards VE

2.5 吸附等溫線(xiàn)模型關(guān)聯(lián)

Langmuir 線(xiàn)性擬合圖，如圖5（a）所示；Freundlich 線(xiàn)性擬合圖，如圖5（b）所示。擬合數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。由擬合結(jié)果得知，Langmuir 模型擬合得出飽和吸附量是52.083 mg/g，這與通過(guò)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)所測(cè)的最大吸附量38.12 mg/g 差別較大，說(shuō)明此模型對(duì)VE 聚合物的關(guān)聯(lián)效果不好。Freundlich 模型計(jì)算所得1/n 值為0.488 04，說(shuō)明印跡聚合物能很好的吸附目標(biāo)物，單位濃度吸附量則為1.608 mg/g。Freundlich 模型的相關(guān)系數(shù)為0.991 98，高于Langmuir 模型，這表明Freundlich 模型更適用于VE 印跡聚合物吸附量數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)。

圖5 吸附等溫線(xiàn)擬合圖：（a）Langmuir，（b）FreundlichFig.5 Fitting plots of adsorption isotherm：（a）Langmuir equation，（b）Freundlich equation

表1 印跡聚合物和非印跡聚合物的吸附等溫模型擬合參數(shù)Tab.1 Isotherm model parameters for adsorption of MIPs towards VE

2.6 Scatchard 分析

印跡聚合物與非印跡聚合物的Scatchard 曲線(xiàn)圖如圖6 所示，圖中印跡聚合物的Scatchard 曲線(xiàn)形成了兩個(gè)不同的部分，對(duì)其分別進(jìn)行線(xiàn)性擬合，計(jì)算解離常數(shù)和最大表觀吸附量。具體數(shù)據(jù)可見(jiàn)表2。

由Scatchard 曲線(xiàn)擬合結(jié)果可以得知在VE 印跡聚合物中存在兩種結(jié)合位點(diǎn)，一種特異性結(jié)合位點(diǎn)，另一種是非特異性的結(jié)合位點(diǎn)。在VE 初始濃度較低時(shí)，印跡聚合物中的特異結(jié)合位點(diǎn)優(yōu)先與VE 互相結(jié)合，結(jié)合較為迅速、緊密，因而Scatchard 曲線(xiàn)較陡，解離常數(shù)較?。欢跐舛容^高的條件下，印跡聚合物中的特異性結(jié)合位點(diǎn)快速達(dá)到平衡后非特異性結(jié)合位點(diǎn)逐漸發(fā)揮作用，但其對(duì)VE 的親和力不及特異性結(jié)合位點(diǎn)，Scatchard曲線(xiàn)平緩，解離常數(shù)較大。

非印跡聚合物中只有一種結(jié)合位點(diǎn)，因此其擬合結(jié)果為一條直線(xiàn)；由于這種位點(diǎn)對(duì)模板分子的結(jié)合是非特異性的，Scatchard 擬合曲線(xiàn)斜率平緩，解離常數(shù)相對(duì)印跡聚合物較高。

圖6 印跡聚合物與非印跡聚合物的Scatchard 曲線(xiàn)：(a)印跡聚合物特異性結(jié)合位點(diǎn)，(b)印跡聚合物非特異性結(jié)合位點(diǎn)，(c)非印跡聚合物Fig.6 Scatchard polt of MIPs and NIPs：(a)MIPs specific binding site，(b)MIPs non-specific binding sites，(c)NIPs

表2 印跡聚合物與非印跡聚合物對(duì)維生素E 的Scatchard 擬合參數(shù)Tab.2 Scatchard fitting parameters of MIPs and NIPs towards VE

3 結(jié) 論

VE 在醫(yī)藥、生活等方方面面都有巨大的應(yīng)用價(jià)值，傳統(tǒng)的分離提純方法消耗試劑多污染環(huán)境，提純步驟復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)二步溶脹法合成的分子印跡聚合物，對(duì)VE 的吸附量為38.12 mg/g。靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)所得等溫曲線(xiàn)擬合表明Freundlich 模型（R2=0.992）對(duì)分子印跡聚合物有更好的關(guān)聯(lián)性；Scatchard 模型表明VE 分子印跡聚合物中有兩種結(jié)合位點(diǎn)。應(yīng)用二步溶脹法合成的VE 分子印跡聚合物具有較好的吸附性能。

隨著分子印跡技術(shù)的發(fā)展，將分子印跡聚合物用于結(jié)構(gòu)相似物的分離純化，特別是與色譜分析和吸附分離過(guò)程、固相萃取等領(lǐng)域已成為研究的熱點(diǎn)。本文的工作為進(jìn)一步研究VE 印跡聚合物吸附分離性能提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論基礎(chǔ)，期望分子印跡技術(shù)能成為工業(yè)分離純化VE 的一種有效手段。