不同產(chǎn)地何首烏HPLC指紋圖譜研究

【摘? 要】目的：用高效液相色譜法建立何首烏的指紋圖譜，為何首烏的生產(chǎn)提供質(zhì)量控制方法。方法：采用高效液相色譜法分析，Water X-Terra色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動相：乙腈-0.1 %磷酸水溶液梯度洗脫，流速為1 ml/min，柱溫：25 ℃，檢測波長：265 nm。分析了十批不同產(chǎn)地何首烏指紋圖譜，得出何首烏藥材的指紋圖譜共有模式。結(jié)果：在選定的色譜條件下通過相似度分析確定13個色譜峰構(gòu)成生首烏藥材指紋圖譜的特征峰。結(jié)論：采用HPLC方法所建立的指紋圖譜具有穩(wěn)定性、重復(fù)性好的特點，可以用于何首烏藥材的鑒別和質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】何首烏;HPLC;特征圖譜

何首烏來源于蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥塊根，具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，何首烏主要含有的二苯乙烯苷類和蒽醌類成分，其中二苯乙烯苷具有降低膽固醇[2]、抗衰老[3-4]、提高免疫功能[5]、防治動脈硬化及保護(hù)肝臟等作用[6]，而蒽醌類成分具有潤腸通便，抗菌消炎的功效[7]。

中藥色譜指紋圖譜是一種綜合的、可量化的色譜鑒定手段，可以借以鑒別真?zhèn)巍⒃u價原料藥材、半成品和成品質(zhì)量均一性和穩(wěn)定性。為了更好的建立何首烏的質(zhì)量控制方法，本實驗擬通過十批不同產(chǎn)地何首烏指紋圖譜，得出何首烏藥材的指紋圖譜共有模式。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20A高效液相色譜儀，SPD-M10Avp二極管陣列檢測器（日本島津），LC Solution 色譜工作站（日本島津）;sartorius電子分析天平。

1.2 試劑與藥材

2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品 （以下簡稱二苯乙烯苷，， 批號： 201005）;大黃素對照品（批號： 110756- 200110）;大黃素甲醚對照品（批號： 110758-200610）均購于中國藥品生物制品檢定所，乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑均為分析純。10批不同產(chǎn)地何首烏樣品，詳見表1，經(jīng)鑒定為蓼科植物何首烏的干燥塊根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Water X-Terra色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 m）;流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）;梯度洗脫：0 ～ 5 min，5% A;5 ～10 min，5% A～15% A;10 min ～ 30 min，15% A ～ 30% A;30 min ～ 60 min，30% A ～ 90% A。流速為1 ml/min，柱溫：25 ℃;檢測波長：265 nm。進(jìn)樣量10 L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

稱取二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚對照品適量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度。搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取何首烏藥材粉末約0.5 g， 精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇25 ml，稱定重量，超聲提取30 min，取出，放涼，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45 m微孔濾膜，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗

取同一份供試品溶液，按“2.1”項下條件重復(fù)進(jìn)樣 5 次，測得的指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相關(guān)系數(shù)均大于0.95，其共有峰的保留時間的 RSD 和峰面積的 RSD 均小于3 %，符合指紋圖譜技術(shù)的要求。

2.3.2 重復(fù)性試驗

精密稱取 6 份同一批藥材粉末，按“2.2.2”項的方法平行制得 6 份供試品溶液，同法進(jìn)行檢測。6 份供試品溶液所測色譜指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的均值相關(guān)系數(shù)（中位數(shù)）均大于 0.95，其共有峰的保留時間的RSD和峰面積的RSD均小于3 %，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，按“2.1”項下條件于 0，3，6，9，18，24 h 進(jìn)樣檢測，測得的指紋圖譜與其所得共有模式圖譜的相關(guān)系數(shù)均大于 0.95，各色譜峰峰面積RSD和保留時間RSD 均小于3 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 樣品測定

分別吸取上述供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。采用MATLA相似度評價軟件對各樣品色譜圖的原始數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析，以10批樣品生成的對照圖譜（中位數(shù)法）作為對照模版，計算各色譜圖的整體相似度，結(jié)果見表2。從表可以看出各批何首烏藥材質(zhì)量相對穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的建立和辨認(rèn)

對樣品的供試品溶液進(jìn)行HPLC-DAD檢測，得到不同批次何首烏HPLC指紋圖譜（見圖1），對何首烏HPLC色譜圖進(jìn)行共有峰識別，確定有13個共有峰（見圖2），構(gòu)建了何首烏藥材的HPLC色譜圖的指紋特征，作為何首烏鑒別的依據(jù)，其中4號峰為二苯乙烯苷，11號峰為大黃素，13號峰為大黃素甲醚，以二苯乙烯苷為對照，得出13個共有峰相對保留時間重現(xiàn)性較好，RSD為0.03 %～1.0 %;相對峰面積差異較大，其RSD為38.22 %～99.82 %。表明不同產(chǎn)地何首烏藥材其組成成分基本上一致，但各峰的峰面積有差異，表明各成分含量存在差異。

3 討論

3.1 提取溶劑的考察

分別用95 %乙醇、75 %乙醇、50 %乙醇、95 %甲醇、75 %甲醇、50 %甲醇6種溶劑各25 mL提取，結(jié)果表明95 %甲醇提取出峰最多，指示95 %的甲醇提取出的何首烏化學(xué)成分更全面。

3.2 提取方法的考察

分別采用了加熱回流30 min提取、加熱回流1 h提取、超聲30 min提取、超聲45 min提取。結(jié)果顯示同一提取方法提取時間不同差別不大，其中超聲提取比加熱回流提取效果要好。所以選擇30 min超聲提取作為提取方法。

3.3 流動相的選擇

甲醇-水，甲醇-0.1 %磷酸，乙腈-0.1 %磷酸等不同流動相組合考察結(jié)果顯示，以乙腈-0.1 %磷酸為流動相，能較好地使樣品中各色譜峰分離，且峰性對稱。故選乙腈-0.1 %磷酸作為流動相系統(tǒng)。

3.4 檢測波長的選擇

對供試品溶液進(jìn)行200 ～ 800 nm全波長掃描，其最佳吸收波長為265 nm，能給出最全、最佳的出峰信息，確定其為方法學(xué)考察波長。

參考文獻(xiàn)

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