門氏柴胡理中顆粒的薄層鑒別及含量測定

靳貝貝 裴香萍 梁惠珍

摘要 目的：建立門氏柴胡理中顆粒定性定量質(zhì)量標準控制方法。方法：采用薄層色譜法對門氏柴胡理中顆粒制劑中柴胡、黃芩進行薄層鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）對柴胡理中顆粒中的黃芩苷進行含量測定，色譜柱為Diamonsil-C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5.0 μm），流動相為甲醇-0.1%醋酸水溶液進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μL.結(jié)果：柴胡、黃芩薄層色譜斑點分離清晰，陰性均無干擾;回歸方程為y=2 907 186.561 0x+21 224.436 6（r=0.999 8），黃芩苷在0.12～1.20 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。平均加樣回收率為99.45%，RSD為2.48%。結(jié)論：建立的方法方便、可靠，可作為門氏柴胡理中顆粒的薄層鑒別和含量測定質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞 門氏柴胡理中顆粒;薄層色譜;高效液相色譜法;含量測定;柴胡;黃芩;半夏;黃芩苷

Abstract Objective：To establish a qualitative and quantitative quality standard control method for the Menshi Chaihu Lizhong Granules.Methods：The Bupleurum chinense and Radix Astragali were qualitatively identified by thin-layer chromatography by the Menshi Chaihu Lizhong Granules.The content of baicalin in Menshi Chaihu Lizhong was determined by high performance liquid chromatography.Diamonsil-C18 column（200 mm×4.6 mm，5.0 μm）was used.The mobile phase was gradient eluted with methanol-0.1% aqueous acetic acid，the flow rate is 1.0 mL/min，the detection wavelength is 280 nm，the column temperature is 25 ℃，and the injection volume is 10 μL.Results：The chromatographic spots of Bupleurum chinense and Radix Scutellariae were clearly separated and there was no interference in the negative; the regression equation was y=2 907 186.561 0x+21 224.436 6（r=0.999 8），and baicalin had a good linear relationship in the range of 0.12 μg-1.20 μg.The average recovery was 99.45% and the RSD was 2.48%.Conclusion：The established method is reliable and scientific，and can be used for thin-layer identification andqualitative and quantitative quality control of the Menshi Chaihu Lizhong Granules.

Keywords Menshi Chaihu Lizhong Granules; TLC; HPLC; Content determination; Bupleurum chinense; Scutellariae; Pinellia; Baicalin

門氏柴胡理中顆粒為山西首屆名中醫(yī)門九章的臨床經(jīng)方制劑，由柴胡、半夏、黃芩等多味中藥組成，具有清肝補脾利膽等功效;主治往來寒熱，疲乏倦怠，心煩易怒，不欲飲食，舌紅苔白，脈弦者方中柴胡主要化學成分有皂苷類、揮發(fā)油類、黃酮類等[1]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、抗菌、抗病毒等藥理活性[2-6];黃芩主要化學成分有黃酮類、揮發(fā)油等[7]，具有抗病毒、抗炎等多種藥理作用[8-9]。半夏主要化學成分有生物堿類、聚醇類、其他化合物等[10]，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗胃潰瘍和改善胃功能、抗腹瀉等藥理作用[11-13]?，F(xiàn)在藥理學研究表明柴胡與黃芩配伍解熱抗炎作用增強并具有抗抑郁作用[14-15]。此經(jīng)方臨床用量大，但多以傳統(tǒng)湯劑為主，有煎煮不便、不易攜帶等缺點，而中藥顆?？芍苯記_服，適應(yīng)快節(jié)奏社會生活，因此為滿足社會需求，將此經(jīng)方制成顆粒劑，本試驗主要對門氏柴胡理中顆粒進行定性定量控制，對制劑中柴胡、半夏、黃芩進行薄層鑒別，并采用高效液相色譜法（HPLC）測定門氏柴胡理中顆粒中黃芩苷的含量，建立門氏柴胡理中顆粒定性定量質(zhì)量標準，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀及2998PDA光電二極管矩陣檢測器（美國Waters公司，型號：Waters-e2695）;普利賽斯十萬分之一電子天平（杭州俊升科學器材有限公司，型號：EP/ES125SM）;萬分之一電子天平（上海析平科學儀器有限公司，型號：XP）;小型萬能粉碎機（濟南科翔實驗儀器有限公司，型號：FW80）;紫外儀（北京六一生物科技有限公司，型號：WD-9403C）;實驗用干燥箱（上海艾測科技有限公司，型號：A231399）;電熱恒溫水浴鍋（南京威美特科學儀器有限公司，型號：JHF1-DK-S28）;超聲波清洗器（濟寧科源超聲波設(shè)備有限公司，型號：KC-240）。

1.2 試劑 柴胡皂苷a對照品（批號：110777-201510，純度為93.2%），柴胡皂苷d對照品（批號：110778-201510，純度為95.8%），黃芩苷對照品（批號：110715-201619，純度為93.5%），漢黃芩素對照品（批號：111514-201605），黃芩素對照品（批號：111595-201607，純度為98.5%）均購于中國食品藥品檢定研究院;薄層層析硅膠G板、聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠，規(guī)格：10 cm×10 cm），純水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 分析樣品 門氏柴胡理中顆粒（批號：20171012、2171014、20171015）由山西黃河藥業(yè)有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 柴胡薄層鑒別 取門氏柴胡理中顆粒8 g，研細，加入50 mL甲醇使溶解，超聲15 min，濾過，將濾液揮干后，濾渣加入5 mL水溶解濾渣，溶解后加入水飽和正丁醇液20 mL，置于分液漏斗中振搖萃取3次，將正丁醇液合并，揮干正丁醇液，濾渣加甲醇定容至5 mL，作為供試品溶液[16]。取柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對照品一定量，加甲醇配制成濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液。另取缺柴胡的門氏柴胡理中顆粒陰性樣品，同法制備柴胡陰性對照溶液。參照2015年版《中華人民共和國藥典》通則0502試驗[17]，分別吸取上述溶液各12 μL、5 μL、12 μL，點于同一薄層層析硅膠G板，展開劑為乙酸乙酯-乙醇-水（8∶2∶1），展開，取出，揮干展開劑，噴10%的硫酸乙醇溶液，105 ℃下加熱至斑點清晰，在供試品與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)相同顏色的斑點，且陰性無干擾，結(jié)果見圖1。

2.1.2 黃芩薄層色譜 取門氏柴胡理中顆粒8 g，研細，加入50 mL乙酸乙酯-甲醇（3∶1）的溶液，采用加熱回流法加熱提取30 min，放冷至室溫，將濾液揮干后，濾渣加入5 mL甲醇溶解，取上清液作為供試品溶液。另同法制黃芩對照藥材溶液[18]。再制備濃度為0.5、1.0、0.5 mg/mL的黃芩素對照品、黃芩苷對照品、漢黃芩素對照品溶液。另取缺黃芩的門氏柴胡理中顆粒陰性樣品，同法制備黃芩陰性對照溶液。吸取上述溶液3 μL、2 μL、3 μL、3 μL，點于同一聚酰胺薄膜上，展開劑為甲苯-丙酮-甲醇-乙酸（8∶1∶1∶1），預(yù)飽和10 min，展開，取出，揮干展開劑，置紫外光燈（365 nm）下檢視。在供試品與黃芩對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點;并與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯3個相同的暗色斑點，且陰性無干擾，結(jié)果見圖2。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇（A）-0.1%醋酸溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序見表1;流速：1.0 mL/min;檢測波長：280 nm;柱溫：25 ℃;進樣量：10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 取黃芩苷對照品一定量加甲醇制成濃度為0.12 mg/mL的黃芩苷對照品溶液[19]。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取門氏柴胡理中顆粒5.0 g，稱定重量，加甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理20 min，放冷，以甲醇補足失重，濾過，取續(xù)濾液為供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取缺黃芩的門氏柴胡理中顆粒陰性樣品，按照“2.2.3”的方法制成黃芩陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性考察 分別將上述制備的溶液按“2.2.1”項下的色譜條件下進樣檢測，進樣量為10 μL，試驗結(jié)果表明，陰性無干擾。見圖3。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項下的對照品儲備溶液，分別取0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mL稀釋至2mL容量瓶中，各精密吸取10 μL，按“2.2.1”項下的色譜條件注入高效液相色譜儀檢測，記錄峰面積。以進樣質(zhì)量（μg）為橫坐標，峰面積值為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y=2 907 186.561 0x+21 224.436 6（r=0.999 8）。結(jié)果表明，黃芩苷在0.12～1.20 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗 按“2.2.1”項下的色譜條件精密吸取對照品溶液（0.06 mg/mL）10 μL，進樣6次檢測，記錄峰面積，黃芩苷的峰面積RSD為0.84%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.3”項下的供試品溶液10 μL分別于0、2、4、8、10、12 h時進行進樣檢測，記錄峰面積值，黃芩苷的峰面積RSD為2.07%，表明在12 h內(nèi)樣品基本穩(wěn)定。

2.2.9 重復性試驗 稱取同一批樣品5 g，精密稱定，共6份，按照“2.2.3”項下的制備方法制備，按照“2.2.1”項下的色譜條件進行進樣測定，樣品平均含量為0.526 6 mg/g，RSD為2.13%，表明該方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取樣品，研細，精密稱取2.5 g，加入黃芩苷對照品1.3 mg，加入甲醇定容至50 mL，超聲20 min，按照“2.2.1”項下的色譜條件進行進樣測定，平均加樣回收率為99.45%，RSD為2.48%，結(jié)果見表2。

3 討論

柴胡的薄層鑒別過程中，供試品制備中樣品加甲醇超聲處理后，濾過，濾液濃縮后作為供試品，薄層色譜結(jié)果斑點拖尾嚴重，后查閱相關(guān)文獻[16]，調(diào)整供試品制備方法，結(jié)果顯示柴胡皂苷d斑點幾乎看不到，但柴胡皂苷a斑點清晰，參考文獻[20]，發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷d在水煎煮液中會全部轉(zhuǎn)化為柴胡皂苷b2。

黃芩薄層鑒別中展開劑參照《中華人民共和國藥典》2015版黃芩項下的薄層色譜條件[18]，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）為展開劑，飽和30 min，展開后，斑點拖尾嚴重，后參考文獻報道，多次調(diào)整展開條件更換展開劑，以甲苯-丙酮-甲醇-冰乙酸（8∶1∶1∶1）為展開劑，結(jié)果顯示斑點分離清晰。

色譜條件篩選時，實驗初期分別以乙腈-0.1%醋酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相進行了考察，供試品中黃芩苷色譜峰峰形較差，后選用甲醇-0.1%醋酸水進行梯度洗脫時色譜峰分離度高，峰形良好且專屬性、重復性較好，可為建立門氏柴胡理中顆粒定性定量質(zhì)量控制標準提供可靠的方法。

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（2019-01-07收稿 責任編輯：張雄杰）