辣椒抗白粉病基因CaML04的克隆和表達(dá)分析

肖仲久　李小霞　宋培勇

摘要：MLO基因是植物中特有的一類抗病負(fù)調(diào)控因子，該基因突變導(dǎo)致植物產(chǎn)生廣譜抗病性。為研究MLO基因在辣椒中表達(dá)模式及功能分析，以前期本課題組通過SSH文庫(kù)獲得的ESTs，設(shè)計(jì)引物，采用RT- PCR和RACE的方法，成功克隆了一個(gè)CaML04基因，并對(duì)該基因的特性和表達(dá)模式進(jìn)行了初步分析，結(jié)果顯示了該CaML04基因可能參與辣椒白粉病的調(diào)控過程。

關(guān)鍵詞：辣椒;MLO基因;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S641 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944 （2020） 2-0188-03

1 引言

辣椒在我國(guó)栽培面積約100多萬hm2[1]婦，面積居蔬菜的第二位，消費(fèi)人群高達(dá)5億多人[2]。在我國(guó)，以貴州、湖南、重慶等16個(gè)省份為重點(diǎn)辣椒種植區(qū)，辣椒產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為我國(guó)許多省區(qū)農(nóng)業(yè)增效和農(nóng)民增收的一條重要途徑。辣椒白粉?。↙eveillula taurica）是一種世界性病害，已經(jīng)相繼在我國(guó)各辣椒產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生[3-6]。

MLO基因最早是在禾本科植物類中描述的，MLO家族成員在單子葉和雙子葉植物中起到調(diào)節(jié)宿主對(duì)白粉病菌響應(yīng)的作用[7，8]。學(xué)者們目前已對(duì)擬南芥、水稻、玉米和楊樹中的Mlo基因家族有深入的研究，而在辣椒中報(bào)導(dǎo)較少。因此，本研究以前期獲得的ESTs，設(shè)計(jì)引物，采用RT- PCR和RACE的方法成功克隆了一個(gè)CaML04基因，并對(duì)其序列特性和表達(dá)模式進(jìn)行了初步的分析，以期為辣椒CaML04基因在辣椒抗病分子育種中的應(yīng)用提供依據(jù)[9]。

2 材料與方法

2.1 材料及處理

實(shí)驗(yàn)所用抗病辣椒材料為‘遵辣一號(hào)。辣椒培養(yǎng)條件及白粉菌接種等方法參考文獻(xiàn)[10]。

2.2 RNA提取和cDNA第一鏈合成

所有辣椒組織在液氮中磨成粉末?？俁NA用Tr-izol -步法抽提試劑盒提取，參照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

2.3 CaML04基因的克隆及測(cè)序

利用課題組前期獲得的辣椒ESTs數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)引物，以“遵椒一號(hào)”的cDNA為模板，采用TaKaRa公司的RACE及RT- PCR試劑盒，克隆獲取基因的全長(zhǎng)序列。條帶割膠后用TaKaRa DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收、純化，再用TaKaRa公司的pMD18-T對(duì)回收、純化后的片段進(jìn)行連接，挑取陽性克隆送諾賽基因公司測(cè)序。

2.4 生物信息學(xué)分析

在NCBI網(wǎng)站（http：//www，ncbi.nlm. nih.gov/）上BLASTp進(jìn)行蛋白預(yù)測(cè)，利用Specialized BLAST（ CDDsearch）進(jìn)行保守域分析。在蛋白生物信息學(xué)網(wǎng)站（ http：//www. expasy.org/proteomics）上對(duì)CaM-L04蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、親/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析。

2.5 CaML04基因的表達(dá)分析

2.5.1 半定量RT- PCR分析

根據(jù)CaML04測(cè)序結(jié)果，利用Primer Premier5.00軟件設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)了CaMLO4基因在接種辣椒白粉菌后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)模式，以辣椒Actin基因?yàn)閮?nèi)參調(diào)整半定量RT- PCR的模板用量。RT- PCR反應(yīng)的體系為25μL，包括：經(jīng)內(nèi)參調(diào)整的適宜體積的cD-NA模板，10×PCR buffer 2.5μL， MgC12 （25mol/L），dNTP（IO mmol/L）0.5μL，正向引物（10 mmol/L）1μL，反向引物（10 mmol/L）1μL，Taq DNA polymerase（2.5 U/μL）0.5 μL，ddH20補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（擴(kuò)增平臺(tái)期前），最后72℃延伸5 min。

2.5.2 Norther雜交驗(yàn)證

經(jīng)過探針標(biāo)記、標(biāo)記效率檢測(cè)、RNA變性電泳、RNA印跡轉(zhuǎn)移、雜交、洗膜、雜交顯色及拍照等步驟，分析Norther雜交結(jié)果。

3 結(jié)果與討論

3.1 完成辣椒總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

高質(zhì)量的總RNA是構(gòu)建cDNA文庫(kù)的首要前提。本試驗(yàn)采用Trizol 一步法抽提試劑盒（稍作改良）提取辣椒葉片的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280為1.9～2.0，表明所提取的總RNA純度較高，質(zhì)量較好，基本沒有蛋白質(zhì)和DNA殘留;利用1.2%的非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，28S、18S和5SrRNA條帶清晰、無拖尾，且28S帶的亮度約為18S的1.5～2倍;說明所提取的總RNA其完整性較好，所提取的RNA未出現(xiàn)降解，質(zhì)量較好，根據(jù)260nm處的光吸收值計(jì)算RNA樣品的濃度，稀釋RNA濃度至100 ng/μL以備用。為后續(xù)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)提供了可能（圖1）。

3.2 辣椒CaML04基因的克隆

以課題組前期獲得的CaMLO基因的ESTs片段為設(shè)計(jì)引物，利用RT -PCR和RACE技術(shù)，通過多次擴(kuò)增、產(chǎn)物克隆和測(cè)序等手段，從辣椒材料中克隆獲得了1個(gè)CaML04全長(zhǎng)序列。CaML04基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1637 bp，包括1515 bp的ORF，其ORF編碼一個(gè)含有504個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。

CaML04基因編碼的氨基酸：

MGNLEGASFSETPTYAVATVVTVI_VSIGFI_IH GSLKKFGKWLHKTKREPLYAALEKIKEELMVFGL LSLLMGHWIIYVAKICVKASAVSSHFYPCSPPRNK TESAITRFVI_SGSSYSNFSISRLLLSSGHVNYCPE GLQSFASKESLEQLHRFLLVL_GVSHVSYSFFAIAL AMIKIYSWRTWENNAKSMALQRLEGSEEPVANN TRMGRLSTFTFH HTTHPWSQHRAI_VWLLCFSR QFWSSINEADYMALRLGFITTHQLPLTYDFHKY MLRSMEEEFRDIVGISVPLWIFVII.CVFLSFHGTN IYFWISFFPAILILLVGTKLHRVVVKLAVEIMDSSP LEGFHQFNLRDELFWFGKPRFLLRIIQFISFQWE IKGASCFTENHTFl_VIRLSFGVlsoFWCSFVTFP LYVIVAQMGSRYKKTIVSENVRTSLHGWRHKVK ARLEGSVVSPETLLAATSLDSMEEDEADQIHTIVS DQHVTLEQSCTNEISECDELHIPLSPRI

3.3 生物信息學(xué)分析

利用在線軟件ExPASy中的ProtParam程序預(yù)測(cè)CaML04蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明：該蛋白的分子式為C2659H4075N6830715S21，由8153個(gè)原子組成，分子質(zhì)量為57724. 01，氨基酸總數(shù)為504，含量最多的是亮氨酸（11.5%），其次是絲氨酸（10.7%）、笨丙氨酸和纈氨酸（7.3%）;帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為43，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為46，說明該蛋白帶正電荷;總平均親水性（ GRAVY）為0.176，為疏水性蛋白;理論等電點(diǎn)為8. 29，為偏堿性蛋白;摩爾消光系數(shù)為24930，在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞內(nèi)的半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為43. 38，脂肪指數(shù)為98. 61，根據(jù)Gu-ruprasad方法表明CaML04為不穩(wěn)定蛋白。利用在線軟件ExPASy中的ProtScale程序預(yù)測(cè)CaML04蛋白的親水性/疏水性（圖2），294位點(diǎn)處有最大值為3. 678，100位點(diǎn)處有最小值為-2. 322，故CaML04蛋白為疏水性，與理化性質(zhì)預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

跨膜結(jié)構(gòu)域是膜中蛋白與膜脂結(jié)合的主要部位，一般由20個(gè)左右的疏水氨基酸殘基組成，形成a螺旋，與膜脂相結(jié)合。預(yù)測(cè)和分析跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)φJ(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、分類以及在細(xì)胞中的作用部位均存在一定的意義。利用TMHMM2.O Serve在線軟件對(duì)CaM-L04基因的氨基酸進(jìn)行了跨膜結(jié)構(gòu)域的分析。如圖3所示，CaML04蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果均顯示包含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)（ seven- TM）。CaML04蛋白的6次跨膜結(jié)構(gòu)域，分別在15 - 35，61- 83， 157 - 179. 281 - 300，305-322，392-414個(gè)氨基酸處形成跨膜的結(jié)構(gòu)域。

利用 NCBI 中的 Conserved Domain Database（ CDD）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CaML04蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示（圖4）該蛋白為MLO蛋白超家族成員。利用在線軟件PSORT II Prediction分析CaML04蛋白的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白在plasma membrane中分布最多，達(dá)60. 9%，其次為endoplasmic reticulum和vacuolar，達(dá)13.0%，再次是nuclear，mitochondrial，Golgi中也有分布，達(dá)4.3%。利用在線軟件SWISS-MODEI。對(duì)CaML04蛋白進(jìn)行同源模建，預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，其最佳模型是（圖5），序列一致性為23. 08%;另一模型是4ib4.1，A。

3.4 CaML04基因表達(dá)模式分析

RT- PCR分析表明（圖6），樣品在35個(gè)循環(huán)時(shí)就有大量擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，說明供試基因在白粉菌接種后的cDNA群體中表達(dá)豐度較高，在未接種白粉時(shí)CaML04基因有一定的本底表達(dá)，接種白粉病菌后24 h表達(dá)量開始升高，36 h時(shí)達(dá)到最大，后續(xù)出現(xiàn)了較明顯的下調(diào)，基因的Northern雜交中（圖7），可以看出，在oh時(shí)就略微有表達(dá)，在36h時(shí)開始增加，并且在以后的48h表達(dá)量最高，與RT- PCR驗(yàn)證有一些區(qū)別。這與已經(jīng)報(bào)道的擬南芥和甜瓜MLO基因表達(dá)模式相似，說明CaML04基因可能參與辣椒白粉病的調(diào)控過程。

4 結(jié)論

白粉病是辣椒生產(chǎn)上重要的病害之一，主要是葉片受害。抗病育種是解決辣椒白粉病的一種有效方法[11]。MLO是植物所特有且廣泛存在的基因家族，不同植物中的MLO家族成員數(shù)差異較大，但其中多數(shù)MLO基因的功能尚不明確[12，13]。研究發(fā)現(xiàn)，本研究克隆的CaML04受到白粉病菌的誘導(dǎo)，在未接種白粉時(shí)CaML04基因有一定的本底表達(dá)，接種白粉病菌后24h表達(dá)量開始升高，36～48 h時(shí)達(dá)到最大，后續(xù)出現(xiàn)了較明顯的下調(diào)，說明CaML04基因可能參與辣椒白粉病的調(diào)控過程，推測(cè)其為辣椒白粉病抗性相關(guān)基因，目前CaML04的功能作用仍在進(jìn)一步研究中。因此，通過對(duì)辣椒ML04基因的克隆及序列特性的分析，可為后續(xù)MLO基因在辣椒抗病分子育種中的應(yīng)用提供重要信息。

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作者簡(jiǎn)介：肖仲久（1980-），男，教授，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)。