娑羅子中抗炎活性成分的計(jì)算機(jī)虛擬篩選

宋煒　袁橋玉　王靜　胡貝　李竣　劉新橋

摘要：利用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)探究了植物娑羅子中抗炎的活性成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中利用里賓斯基五規(guī)則篩選出娑羅子的化學(xué)成分，用SYBYL軟件對(duì)小分子與抗炎作用相關(guān)的16個(gè)蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，通過(guò)對(duì)接打分函數(shù)（Total Score≥7）篩選出活性成分;采用Discovery Studio軟件分析了蛋白復(fù)合體的相互作用;利用admetSAR軟件分析了對(duì)接結(jié)果較好的幾個(gè)化合物的ADMET預(yù)測(cè)。結(jié)果表明：七葉皂苷苷元A與JINK3結(jié)合最好，山奈酚與iNOS結(jié)合最好，槲皮素和七葉苷與JAK1結(jié)合最好，秦皮苷ERKI、JNK3、MIF結(jié)合都好;蛋白復(fù)合體的分析結(jié)果顯示疏水作用力和氫鍵在對(duì)接中發(fā)揮重要作用。5個(gè)化合物的ADMET存在一定的不足，成藥時(shí)應(yīng)該稍加修飾使其具有更好的ADMET。此研究為中藥娑羅子化學(xué)成分的抗炎研究提供了參考，也為新藥研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：娑羅子;計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì);分子對(duì)接;ADMET預(yù)測(cè)

中圖分類號(hào)：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944（ 2020）2-0180-05

1 引言

娑羅子為七葉樹科植物七葉樹（Aesculus chinensisBge.）、浙江七葉樹（Aesculuschinewis Bge. var. cheLzi-angensis（ HuetFang） Fang）或天師栗（Aesculus wil.soniiRehd.）的干燥成熟種子;均作為常用中藥收入到《中國(guó)藥典》。其性溫，味甘，歸肝、胃經(jīng)，具有疏肝、理氣、和胃、止痛之功效[1]。娑羅子具有抗炎消腫作用[2]，但是確切的抗炎靶點(diǎn)和作用機(jī)制尚未報(bào)道。通過(guò)常規(guī)篩選和高通量篩選需要大量的人力和物力，而計(jì)算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計(jì)（ computer- aided drug design，CADD）是利用計(jì)算機(jī)化學(xué)基本原理，通過(guò)模擬藥物與受體生物大分子的相互作用，合理設(shè)計(jì)新型先導(dǎo)化合物的藥物設(shè)計(jì)方法，它的使用也極大地減少了新藥創(chuàng)制的盲目性和偶然性[3]。根據(jù)配體與受體作用的“鎖匙原理”，分子對(duì)接可以有效地確定與靶受體活性部位空間和電性特征相匹配的小分子化合物;目前，計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)已廣泛運(yùn)用于中藥及其復(fù)方藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制的研究[3]。

藥物開發(fā)中不良的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和毒性（ ADMET）是藥物開發(fā)失敗的主要原因之一，因此在藥物研發(fā)的早期，即對(duì)化合物的ADMET性質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，以便將具有不良ADMET性質(zhì)的化合物盡早排除，這樣能有效降低藥物開發(fā)的失敗率。但實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)化合物的ADMET性質(zhì)，代價(jià)大、周期長(zhǎng)，且動(dòng)物數(shù)據(jù)與人體數(shù)據(jù)并不完全一致，因而不能滿足現(xiàn)代藥物研究的需求。最經(jīng)濟(jì)合理的辦法是使用計(jì)算機(jī)模型對(duì)ADME-性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，這樣的預(yù)測(cè)可以放在化合物成藥之前進(jìn)行，因此具有重要的研究意義[4]。

因此，本實(shí)驗(yàn)基于分子對(duì)接技術(shù)和ADMET預(yù)測(cè)，從中藥娑羅子中篩選抗炎活性的天然配體的可能作用靶點(diǎn)，為今后開展研究娑羅子抗炎作用機(jī)制和新藥的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和參考。

2 材料與方法

2.1 程序系統(tǒng)

蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB，美國(guó)紐約結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室開發(fā)，http：//www. rcsb. org/pdb/home/home.do）;Sybyl l.0軟件（美國(guó)Tripos公司）;Discovery Stu-di0 2017 R2 Client（DS，美國(guó)Accelrys公司開發(fā)，ht-tps：//www. 3dsbiovia. com/）。中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（ TCMSP，http：//lsp. nwu. edu. cn/tcmsp.php）;小分子化合物結(jié)構(gòu)下載（PubChem，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心，下載網(wǎng)址：https：//pubchem. ncbi. nlm.nih. gov/）; admetSAR（ http： //lmmd. ecust. edu. cn/ad-metsarl）;ChemDraw。

2.2 方法

2.2.1 配體的準(zhǔn)備

配體分子信息鍵見表1。以“娑羅子”為關(guān)鍵詞，在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索娑羅子的化學(xué)成分，加以I_ipin-ski限制（里賓斯基五規(guī)則指的是氫鍵供體不超過(guò)5（Hon≤5），氫鍵受體不超過(guò)10（HAcc≤10），脂水分配系數(shù)（ALogP）在-2～5之間，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)的數(shù)量（RBN）不超過(guò)10，分子量（MW）小于500[5]），篩選出12個(gè)候選化合物。從Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)下載相應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)，未能在Pubchem下載的化合物用ChemDraw2D畫出其結(jié)構(gòu)，并用Chem3D轉(zhuǎn)為m012格式，建立配體小分子配體化合物庫(kù)。所有配體小分子均采用分子力學(xué)程序中的Minimize進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，賦予Tripos力場(chǎng)及Gasteiger- Huckel電荷，以Powell能量梯度法進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，最大重復(fù)次數(shù)為10000次，優(yōu)化后得到穩(wěn)定構(gòu)象并保存m012格式，為后面分子對(duì)接做準(zhǔn)備。

2.2.2 靶點(diǎn)的準(zhǔn)備

根據(jù)文獻(xiàn)[3，6～11]報(bào)道選取了16個(gè)與炎癥相關(guān)的靶點(diǎn)蛋白作為受體，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載這16個(gè)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，具體蛋白靶點(diǎn)見表2。對(duì)下載的靶蛋白在SYBYL軟件中用Application中的Docking模塊進(jìn)行去水、加氫，加電荷;并根據(jù)靶蛋白復(fù)合物中的配體確定對(duì)接的活性位點(diǎn)，并將處理好的蛋白保存，為后續(xù)分子對(duì)接研究做準(zhǔn)備。

2.2. 分子對(duì)接

以16個(gè)抗炎蛋白靶點(diǎn)作為受體，12個(gè)小分子化合物為配體在SYBYLI.O軟件中Surflex - dock模塊進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接結(jié)果以對(duì)接總得分（ Total Score）呈現(xiàn);Total Score用來(lái)反應(yīng)配體與受體的親和力大小，它綜合考慮到了極性作用、疏水作用、焓和溶劑化等因素，該值越大，對(duì)接復(fù)合物越穩(wěn)定，說(shuō)明小分子配體與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合的越好。Total Score≥7認(rèn)為小分子配體與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合活性較好[12]。采用DS軟件中Re-ceptor- Ligand Interactions模塊對(duì)分子對(duì)接的結(jié)果進(jìn)行分析，并制作二維和三維的效果圖。

2.2.4

ADMET預(yù)測(cè)

根據(jù)分子對(duì)接的結(jié)果，選擇對(duì)接打分高的小分子配體進(jìn)行ADMET預(yù)測(cè)，在admetSAR數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入小分子配體的Smiles格式，然后點(diǎn)擊Predict即可得到該小分子配體有關(guān)數(shù)據(jù)，主要包括血腦屏障通透性（ BBB），人腸道吸收（ HIA），人腸細(xì)胞系滲透性（Cac02 Cell per-meability，CCP），細(xì)胞色素（CYP）酶系的抑制性，AMES測(cè)試用于檢測(cè)可能的誘變劑（ATT），致癌性（Carcino-genicity，Carcino），50%大鼠的致死量（LD50 in Rat）。

3 結(jié)果

3.1 分子對(duì)接結(jié)果

從上述得到的候選化合物的分子對(duì)接結(jié)果來(lái)看，篩選出七葉皂苷苷元A與C - jun N- terminal kinase 3（JNK3）結(jié)合最好，山奈酚與誘導(dǎo)性一氧化氮合酶（iN-OS）結(jié)合最好，槲皮素與酪氨酸激酶1（JAKI）結(jié)合最好，七葉苷與酪氨酸激酶I（JAKI）結(jié)合最好，秦皮苷與Extracellular signal regulated kinase l（ERKI）、C-junN- terminal kinase 3 （JNK3）、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）結(jié)合都好。由表3對(duì)接結(jié)果可知，多成分對(duì)多靶點(diǎn)蛋白共同作用的特點(diǎn)，為娑羅子的抗炎作用機(jī)制研究提供了理論基礎(chǔ);同時(shí)，各成分也可作為相應(yīng)靶蛋白抑制劑的先導(dǎo)化合物加以研究。具體的對(duì)接打分見表3。

3.2 對(duì)接結(jié)果分析

5個(gè)候選化合物與對(duì)應(yīng)的炎癥靶點(diǎn)之間形成的氫鍵與疏水作用見表4。以對(duì)接打分最高化合物12（秦皮苷）與ERK1相互作用蛋白復(fù)合物為例做它們間相互作用力的分析圖（圖1、圖2）。

從圖2可以看出，秦皮苷與氨基酸殘基LEU173、ALA69、VAL56有疏水相互作用力，與殘基GLU50、GLY54、CYS183、ASP184、SER170形成了氫鍵。

3.3 ADMET預(yù)測(cè)結(jié)果

5個(gè)具有潛在抗炎活性分子的ADMET預(yù)測(cè)結(jié)果見表5。

BBB的陽(yáng)性結(jié)果代表藥物分子能輕易透過(guò)血腦屏障，接近1的值表示透過(guò)BBB的更好的滲透性，陰性結(jié)果代表不能輕易透過(guò)血腦屏障;腸是吸收口服藥物的的主要部位，HIA的陽(yáng)性結(jié)果表明它們的化合物可以通過(guò)人腸吸收或同化，接近1的值表示通過(guò)腸更好的吸收。CCP的陽(yáng)性結(jié)果代表能輕易透過(guò)人腸細(xì)胞系，接近1的值表示透過(guò)CCP的更好的滲透性。AMES測(cè)試值“None”代表該化合物無(wú)誘變毒性，“AMES toxic”代表該何物有誘變毒性。Carcino代表致癌性。LD50 inRat的值代表著能使半數(shù)老鼠死亡的所需的最低化合物濃度（單位：mol/kg），其數(shù)值越大代表該化合物成藥后安全性更高。

3.4 ADMET結(jié)果分析

七葉皂苷苷元A、山奈酚與七葉苷能透過(guò)血腦屏障，槲皮素與秦皮苷不易透過(guò)血腦屏障;5個(gè)候選化合物均能經(jīng)人腸吸收或同化，其中七葉皂苷苷元A、山奈酚與槲皮素能很好地經(jīng)人腸吸收或同化;秦皮苷易透過(guò)人腸細(xì)胞系，具有很好地滲透性，其它4個(gè)候選化合物不易透過(guò)人腸細(xì)胞系，但秦皮苷具有誘變毒性;5個(gè)化合物均無(wú)致癌性。山奈酚與槲皮素對(duì)細(xì)胞色素（ CYP）酶系具有高抑制，七葉皂苷苷元A、七葉苷與秦皮苷對(duì)細(xì)胞色素（CYP）酶系的抑制性低。綜上可得5個(gè)候選化合物在人體的吸收、分布、代謝、排泄和毒性某一個(gè)方面或多個(gè)方面存在的問(wèn)題。成藥時(shí)應(yīng)該考慮其AD-MET性質(zhì)，對(duì)其結(jié)構(gòu)稍加修飾，使其化合物有更好的ADMET性質(zhì)，在人體內(nèi)有適宜的吸收、分布、代謝、排泄且無(wú)毒。

4 結(jié)論

本研究以Sybyl軟件的Surflex- dock模塊對(duì)娑羅子中的12個(gè)化學(xué)成分與16個(gè)炎癥靶點(diǎn)對(duì)接，虛擬篩選出七葉皂苷苷元A、山奈酚、槲皮素、七葉苷、秦皮苷5個(gè)化合物具有抗炎活性的小分子化合物（ Total score≥7）。從計(jì)算機(jī)虛擬篩選的角度驗(yàn)證中藥娑羅子具有抗炎作用的化學(xué)成分，為闡述娑羅子抗炎機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。然后應(yīng)用Discovery Studio Visualizer軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果最好的蛋白復(fù)合物的相互作用力進(jìn)行分析，說(shuō)明疏水作用與氫鍵在分子對(duì)接中起著重要的作用。最后對(duì)篩選的5個(gè)化合物做ADMET預(yù)測(cè)，ADMET的預(yù)測(cè)可以給新藥研發(fā)的成藥過(guò)程中的給予一定理論指導(dǎo)和幫助。綜上所述：計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)和ADMET預(yù)測(cè)不僅顯著提高了藥物設(shè)計(jì)速度，還減少了新藥創(chuàng)新所需要的人力與物力，提高了先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)率和成藥的可能性，為中藥的抗炎活性奠定了基礎(chǔ)。

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作者簡(jiǎn)介：宋煒（1993-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锘瘜W(xué)。

通訊作者：劉新橋（1978-）.男，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。