定量核磁共振技術(shù)的測(cè)試流程

萬(wàn)相勇，徐雪晶，徐英杰，趙錦漪，肖 明，馬小芳，楊世龍*

(1.南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037;2.南京林業(yè)大學(xué) 現(xiàn)代分析測(cè)試中心，江蘇 南京 210037;)

核磁共振技術(shù)普遍用于有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定，隨著高強(qiáng)度磁場(chǎng)以及傅里葉變換技術(shù)的應(yīng)用，儀器的各項(xiàng)性能得到極大的改善，使得其應(yīng)用于定量分析成為了可能。定量核磁共振技術(shù)(Quantitative Nuclear Magnetic Resonance，QNMR))是一種通用技術(shù)，只要含1H、19F、13C、31P等原子就可以進(jìn)行定量，與其它定量方法相比，QNMR具有諸多優(yōu)點(diǎn)，例如，不需要自身的標(biāo)準(zhǔn)品，不需要引入校正因子，對(duì)樣品無(wú)破壞，定量結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好[1]，因此，近十年，定量核磁工作技術(shù)已廣泛用于制藥、食品、生命科學(xué)、化工等行業(yè)，并被中國(guó)藥典、美國(guó)藥典、歐洲藥典收錄，已成為一種常用的定量手段。為快速、方便地進(jìn)行QNMR實(shí)驗(yàn)，本文總結(jié)了QNMR的原理、內(nèi)標(biāo)峰和內(nèi)標(biāo)物的選擇、實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置以及實(shí)施方法，以期為科研工作提供參考。

1 QNMR的原理

QNMR常用內(nèi)標(biāo)法對(duì)化合物進(jìn)行定量，內(nèi)標(biāo)法以結(jié)構(gòu)已知的化合物作為內(nèi)標(biāo)物，精確稱量?jī)?nèi)標(biāo)物和待測(cè)樣品，用氘代試劑配成混合溶液，選取合適的儀器參數(shù)進(jìn)行測(cè)量，通過(guò)定量峰的面積比，計(jì)算得到待測(cè)樣品的含量，計(jì)算公式如下[2]：

式中，Px和Pstd分別代表樣品和內(nèi)標(biāo)物的純度， Ix和Istd分別代表樣品和內(nèi)標(biāo)物中定量峰的峰面積，Nx和Nstd分別代表樣品和內(nèi)標(biāo)物定量峰對(duì)應(yīng)的氫原子個(gè)數(shù)，Mx和Mstd分別代表樣品和內(nèi)標(biāo)物的摩爾質(zhì)量，mx和mstd分別代表樣品和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量。

2 實(shí)施步驟

QNMR的一般步驟是：首先對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行表征，對(duì)峰進(jìn)行歸屬，選取合適的氘代試劑、內(nèi)標(biāo)物和定量峰，然后將內(nèi)標(biāo)物和被測(cè)物質(zhì)準(zhǔn)確稱重，用氘代試劑溶解，放入儀器中，調(diào)節(jié)相關(guān)儀器參數(shù)，進(jìn)行測(cè)試，根據(jù)公式計(jì)算含量。為進(jìn)一步驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，需要進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化、專屬性、重復(fù)性等相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.1 氘代試劑的選擇

氘代試劑的選擇，不僅要考慮溶解性能，而且還要考慮到溶劑對(duì)化學(xué)位移的影響。主要從以下幾點(diǎn)出發(fā)[3-4]，①溶劑峰與樣品峰要分離。②讓定量峰盡量與其它峰有更大的分離度，必要時(shí)可考慮使用混合溶劑，混合試劑可以使在單一試劑中不能完全分離的定量信號(hào)得到完全分離，從而達(dá)到單一試劑無(wú)法達(dá)到的效果。③注意溫度對(duì)氘代試劑的影響，使用易揮發(fā)的溶劑，例如氘代氯仿，不易升溫，以免加快揮發(fā)，影響測(cè)試結(jié)果。

2.2 定量峰和內(nèi)標(biāo)物的選擇

定量峰的選擇對(duì)測(cè)試結(jié)果影響大，在選擇定量峰時(shí)，應(yīng)從以下幾方面著手[5]：①定量峰與其它峰分離度要好。②首選單峰，其次選擇帶有裂分的峰。③對(duì)于定量氫譜，選擇非活潑氫，定量結(jié)果會(huì)更加準(zhǔn)確。

內(nèi)標(biāo)物的選擇除了滿足定量峰的要求外，還需要考慮以下幾點(diǎn)：①內(nèi)標(biāo)物結(jié)構(gòu)與性質(zhì)穩(wěn)定，不與溶劑、樣品等反應(yīng)。②縱向馳豫時(shí)間(T1)較短。③內(nèi)標(biāo)物定量峰對(duì)應(yīng)的原子核的化合物環(huán)境最好與樣品的相似。④廉價(jià)，易得，無(wú)毒或低毒。常見(jiàn)的內(nèi)標(biāo)物有苯、苯甲酸、二甲基亞砜、馬來(lái)酸等。

總之，定量峰與內(nèi)標(biāo)物的選擇相互配合，各個(gè)因素綜合考慮，除上述因素外，最好讓樣品的定量峰與內(nèi)標(biāo)物的定量峰位置相近，且不相互干擾，這樣，測(cè)試結(jié)果會(huì)更加準(zhǔn)確。

三是還未形成核心服務(wù)產(chǎn)品。Z公司可為入駐企業(yè)提供場(chǎng)地、會(huì)務(wù)、安保、保潔、餐飲等基礎(chǔ)服務(wù)，以及人力資源服務(wù)和政策性融資服務(wù)等簡(jiǎn)單的增值服務(wù)，但在投融資以及技術(shù)創(chuàng)新等高端的企業(yè)孵化服務(wù)方面的認(rèn)識(shí)不夠，未能找到適合入駐企業(yè)及自身切實(shí)需求的核心服務(wù)產(chǎn)品。

2.3 主要參數(shù)設(shè)置

由QNMR的計(jì)算公式可以看出，影響結(jié)果的主要因素只有峰面積是需要測(cè)量的，因此，與儀器參數(shù)設(shè)置密切相關(guān)，影響峰面積的儀器參數(shù)主要有儀器的磁場(chǎng)強(qiáng)度、掃描次數(shù)、馳豫延遲時(shí)間、采樣時(shí)間、增益值、脈沖程序等[6-7]。

2.3.1 磁場(chǎng)強(qiáng)度

磁場(chǎng)強(qiáng)度是儀器的主要參數(shù)，一般情況下，儀器磁場(chǎng)強(qiáng)度越高，靈敏度越高，分辨率越高，檢測(cè)限就可能會(huì)很低，更加適用于微量樣品的檢測(cè)。通常情況，400MHz以上的核磁共振譜儀用來(lái)做QNMR研究就足夠了。

2.3.2 馳豫延遲時(shí)間

馳豫延遲時(shí)間(D1)是一個(gè)重要的參數(shù)，D1主要與化合物中原子的縱向馳豫時(shí)間(T1)相關(guān)。在QNMR實(shí)驗(yàn)時(shí)，一般要求D1≥5T1，如果D1過(guò)短，縱向磁化矢量不能完全恢復(fù)，所收集的峰面積不準(zhǔn)確，就會(huì)造成結(jié)果不準(zhǔn)確；但如果D1過(guò)長(zhǎng)，則造成測(cè)試時(shí)間很長(zhǎng)。因此，獲得合適D1值很重要。實(shí)驗(yàn)前最后測(cè)量下T1，從而確定合適的D1值。一般有兩種途徑，第一種，測(cè)量精確的T1值，核磁軟件一般帶有測(cè)量T1值的功能，可利用軟件進(jìn)行測(cè)試。第二種可以采集不同D1值下的圖譜，當(dāng)定量峰峰面積不再變化時(shí)，可認(rèn)為此時(shí)的D1值為最佳值[8]。此外，對(duì)于13C QNMR，由于13C的T1值很大，可加入馳豫試劑，縮短T1值，常用的弛豫試劑為乙酰丙酮鉻[9]。

2.3.3 采樣時(shí)間

采樣時(shí)間指信號(hào)衰減為噪音所用的時(shí)間，采樣時(shí)間過(guò)短，信號(hào)未完全衰減即停止采集，則會(huì)發(fā)生截尾現(xiàn)象，傅里葉變換后，可能產(chǎn)生錯(cuò)誤的峰，如果采樣時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，譜圖中含有過(guò)多的噪音，造成分辨率下降，同時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

2.3.4 掃描次數(shù)

掃描次數(shù)對(duì)提高譜圖的信噪比有很大幫助，掃描次數(shù)越多，信噪比越大，定量結(jié)果也更準(zhǔn)確，但掃描次數(shù)太多，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，1H QNMR、19F QNMR、31P QNMR次數(shù)可以低，一般16～128次，對(duì)于13C QNMR掃描次數(shù)可能需要上千次。

2.3.5 其他參數(shù)

影響QNMR的參數(shù)有很多，有些參數(shù)雖然影響不明顯，但如果進(jìn)行優(yōu)化，定量效果會(huì)更好，例如，脈沖角度最好選用90°脈沖角。在確保信號(hào)不會(huì)溢出的情況下，增益值最好選擇最大值并保持一致，以提高信噪比。共振頻率中心最好在樣品和內(nèi)標(biāo)物定量峰之間，以達(dá)到最佳的共振效果。此外，在測(cè)試時(shí)，采用溶劑峰壓制、旋轉(zhuǎn)樣品等方法，也可以提高信噪比，提高測(cè)試準(zhǔn)確度[6]。

2.3.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理時(shí)，不僅要對(duì)每張圖譜進(jìn)行仔細(xì)的化學(xué)位移校正、相位校正和基線校正；而且還可以采用其它方法，提高QNMR的準(zhǔn)確度，例如，采用窗函數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可以提高信噪比；積分應(yīng)該采用固定范圍的方式進(jìn)行積分，確保積分的準(zhǔn)確性；進(jìn)行沖零操作，可以提高圖譜的分辨率。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

對(duì)QNMR方法學(xué)的驗(yàn)證主要從線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收等方面進(jìn)行考察，考察合格，方能作為定量方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試[10-13]。

3.1 線性關(guān)系

考查線性關(guān)系時(shí)，可配制不同濃度的樣品，加入相同濃度的內(nèi)標(biāo)物，同時(shí)測(cè)定譜圖，以樣品定量峰與內(nèi)標(biāo)定量峰的面積比為縱坐標(biāo)，以樣品與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量比為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制曲線，線性相關(guān)系數(shù)越接近1，線性關(guān)系越好。

3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

考查精密度時(shí)，制備一個(gè)樣品，加入內(nèi)標(biāo)物后，連續(xù)測(cè)量5次以上，計(jì)算樣品定量峰與內(nèi)標(biāo)定量峰面積比的RSD值，一般要求RSD<2%。

3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

平行制備5份以上樣品和內(nèi)標(biāo)的混合供試液，同一條件下測(cè)定譜圖，根據(jù)兩者定量峰的面積比，計(jì)算樣品的濃度，根據(jù)多次計(jì)算結(jié)果求出RSD值，一般要求RSD<2%。

3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

制備一個(gè)含有樣品和內(nèi)標(biāo)物的供試液，每隔一定的時(shí)間測(cè)定一次譜圖，計(jì)算樣品定量峰和內(nèi)標(biāo)定量峰的面積比，并計(jì)算RSD，可以得到穩(wěn)定性的結(jié)果，一般要求RSD<2%。經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)后，線性關(guān)系好，精密度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的定量方法才可以用于測(cè)定實(shí)際樣品。

4 總結(jié)

QNMR技術(shù)集樣品定性與定量于一體，與其它定量方法相比，具有諸多優(yōu)勢(shì)，已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)之一。隨著高場(chǎng)核磁和高端軟件的研發(fā)，QNMR技術(shù)在藥物、食品、生命科學(xué)、化工等領(lǐng)域應(yīng)用前景將更加廣泛。故本文綜述了QNMR的原理、內(nèi)標(biāo)峰和內(nèi)標(biāo)物的選擇、實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置及主要方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，以期為QNMR實(shí)驗(yàn)提供參考。