不同霉菌對白酒丟糟中粗纖維降解試驗

蘭小艷，陳雪玲，郭云霞，張敬慧

(宜賓職業(yè)技術(shù)學院 五糧液技術(shù)與食品工程學院，四川 宜賓 644000 )

白酒丟糟中含有淀粉(10%左右)、粗纖維(20%左右)、粗蛋白(7%～9%)、有機酸、低碳糖、雜醇等有機成分[1]，纖維素的降解是世界性的難題。據(jù)統(tǒng)計[2]：現(xiàn)在全國一年的飼料用糧大概占全國糧食總產(chǎn)量的23%左右，白酒釀造行業(yè)每年耗糧達幾千萬t，而酒糟生產(chǎn)干飼料所節(jié)省的飼料用糧，相當于釀酒用糧的30%。即一個年產(chǎn)萬t的酒糟加工飼料廠，每年可為國家節(jié)省飼料糧萬噸以上[3]。酒糟中纖維素含量較高，對除反芻動物以外的牲畜的適口性較差，因此降解酒糟中纖維素的含量顯得尤為重要[4]。所以搞好酒糟的綜合利用，在節(jié)糧的基礎(chǔ)上還可以增加經(jīng)濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗所用菌種名稱康寧木霉(Trichoderma koningii)，來源于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC),CICC編號為40852；白腐菌，來源于四川省南開大學生物研究室，編號為30942；白酒丟糟，由四川省宜賓某酒業(yè)提供；麩皮為市售；高壓滅菌鍋(XFS-280MB+)，購自光合電子有限公司；超凈工作臺(SW-CJ-1FD/SW-CJ-2F)，購自力辰科技有限公司；生化培養(yǎng)箱( LRH-70)，購自上海一恒科學儀器有限公司；干燥箱(101-1A)，購自光合電子有限公司；電子天平(萬分之一)，購自萬特電子有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法與設(shè)計

1.2.1 設(shè)計分為4組試樣：

試樣1 康寧木霉 20-30℃自然室溫試樣2 康寧木霉 恒溫2 8℃試樣3 白腐霉 20-30℃自然室溫試樣4 白腐霉 恒溫2 8℃

分別在發(fā)酵第0，10，15，20，25，30，35 d測定纖維素的含量，比較纖維素的降解效果。

1.2.2 菌種的活化及擴大培養(yǎng)

將買回來的純種菌株通過平板劃線法轉(zhuǎn)接到滅菌后的斜面試管馬鈴薯培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，觀察菌種的活力，反復(fù)轉(zhuǎn)接，直到菌種的活化程度增強。選擇活化力很強的菌株，將純種的菌株用上述方法轉(zhuǎn)接到更大的試管，繼續(xù)培養(yǎng)得到更多的菌株。

1.2.3 酒糟的預(yù)處理

本試驗所用的酒糟是從四川省宜賓某酒業(yè)取回的鮮糟，取回后立即用pH試紙測其初始酸度值，取其中的一部分酒糟放置在陽光下曝曬，使其水分揮發(fā)待測，另一部分酒糟用培養(yǎng)皿分裝后放于烘箱內(nèi)干燥待測。

1.2.4 酒糟降解試驗

(1)小樣試驗：篩選出經(jīng)過培養(yǎng)后活力較強的菌體，將其轉(zhuǎn)接到添加了1g酒糟的培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)并觀察兩種菌的活化力。培養(yǎng)1周后，發(fā)現(xiàn)兩種菌體都能生長，且菌絲生長茂盛。

(2)降解試驗：選擇培養(yǎng)的康寧木霉和白腐霉純種菌株，分別用等量的無菌水脫洗在裝滿酒糟的無菌瓶中(見圖1)。將試樣2和試樣4置于恒溫培養(yǎng)箱，將溫度調(diào)節(jié)到28℃，周期為五天；將試樣1和試樣3置于室內(nèi)透光、通風、陰涼處，每次多次測其室溫變化；定期檢測酒糟的纖維素含量，分析降解效果。

圖1 降解試驗Fig.1 Degradation test

1.2.5 檢測方法

采用中性洗滌纖維[5]方法，用酸、堿及乙醇依次消化酒糟，灰化后除去無機物即得纖維素。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗纖維的含量測定

表1 經(jīng)康寧木霉發(fā)酵后酒糟纖維含量的測定 %Table 1 the determination of Trichoderma koningii fermented lees fiber content

表2 經(jīng)白腐霉發(fā)酵后酒糟纖維含量的測定 %Table 2 Determination of fiber content of distiller's grains after fermenting white rot

2.2 粗纖維的平均值

表3 酒糟纖維含量的平均值 %Table 3 average fiber content of distiller's grains

2.3 降解纖維素程度的分析

結(jié)合表3及圖2分析，可以得出如下數(shù)據(jù)：

(1)20 ～30℃自然室溫，康寧木霉的降解率為5.06%。尤其是前20天降解效率是最高的。而白腐霉的降解率為5.67%，白腐霉的降解效果是最佳的，尤其是20～25天這一個周期內(nèi)，降解迅速?？偟膩碚f白腐霉的降解率比康寧木霉的降解率高出0.61%。

(2)恒溫28℃，康寧木霉的降解率為5.03%。雖然是降解效率是最差的，但它的降解速率是趨于穩(wěn)定下降的。白腐霉從25.04%降到19.95%，其降解率為5.09%。它的降解速率是最緩慢的，前20天效果不明顯。白腐霉的降解率略高出康寧木霉0.06%。

(3)30天以后，所有試樣的纖維素含量都保持不變。

圖2 纖維素降解效果線形分析Fig.2 linear analysis of cellulose degradation effect

3 小結(jié)

3.1 酸堿度的影響

pH值不同會影響微生物細胞膜所帶電荷的狀態(tài)，改變細胞膜的通透性，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的排泄，菌體在適合的pH值下可以獲得最佳培養(yǎng)效果[6]。根據(jù)相關(guān)資料查出[7]，白腐霉和康寧木霉在pH值為1.5～8.5的范圍內(nèi)都能夠生長，其最適pH值分別為4.5～5.5和4～5。由于本次所用的酒糟是由某酒業(yè)提供的鮮糟，粗測其酸度為3～4，與兩種菌的最適pH值不符，因此，在酒糟中適當添加了2滴NaOH，以調(diào)節(jié)酒糟的酸堿度，使其適合這兩種菌的生長繁殖。

3.2 水分的影響

酒糟中含有適當?shù)乃钟欣诿咕纳L繁殖。據(jù)查證[8]，霉菌的生長繁殖所需的水分含量為40%～50%。在選擇酒糟之前，粗測酒糟中水分含量，相比較而言，經(jīng)太陽曬干的酒糟(其水分含量在44%左右)更適合于霉菌的生長繁殖[9]。此外，太陽曝曬的同時還可以殺滅酒糟中本身存在的雜菌，以及將殘余酒精揮發(fā)掉，更有利于發(fā)酵操作的進行。

3.3 淀粉及脂肪的影響

眾所周知，碳源是構(gòu)成菌體的碳架及能量的來源[10]。酒糟纖維中的木質(zhì)素降解是一個次生代謝過程，必須有其他碳源來支持微生物的生長，而酒糟中殘余淀粉可以被一些酶類分解為單糖，作為微生物的碳源供給[11]。如果殘余淀粉量不足，便會影響霉菌的生長繁殖，使纖維素降解速率下降。

測得該酒糟的淀粉含量為17%，脂肪含量不足5%，不足以提供微生物所需的碳源物質(zhì)，因此在酒糟預(yù)處理中，添加了0.1 %葡萄糖和0.2 %的麥麩，使纖維素的降解率高于資料中顯示的5%。

3.4 蛋白質(zhì)的影響

酒糟中的蛋白質(zhì)可以給霉菌提供有效的氮源，也可以作為飼料中有效的營養(yǎng)成分[12]。根據(jù)研究表明[13]：發(fā)酵酒糟中氮的含量與粗蛋白質(zhì)的提高幅度呈正相關(guān)關(guān)系，但與白腐真菌的生長發(fā)育呈負相關(guān)。氮源的消耗直接影響木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生，木質(zhì)素降解酶為次級代謝酶，在自然狀態(tài)下，通常氮源耗盡才產(chǎn)生[14]。因此，酒糟中氮的含量是影響霉菌降解效果的因素之一。

3.5 溫度的影響

溫度的高低直接影響霉菌的產(chǎn)酶能力，溫度過高，則降低酒糟纖維素中木質(zhì)素的降解率；溫度過低，霉菌固體發(fā)酵的進度緩慢。有資料顯示[15]：30℃培養(yǎng)條件更利于木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生。大多數(shù)霉菌適宜的生長溫度為20～35℃。

本試驗首選的溫度是恒溫28℃，這個溫度適宜兩種菌體的生長繁殖，其次選擇了自然室溫。由于室溫隨時都在改變，所以有很多不確定性，為了降低菌體的衰亡率，每天對室溫進行檢測。由檢測結(jié)果得出室溫的波動范圍在20～30℃，這個溫度范圍不會造成菌體的衰亡，因此本試驗中設(shè)定溫度對降解效果的影響不大。

3.6 其他因素的影響

(1)本次試驗使用的酒糟在發(fā)酵過程中是敞開無菌瓶蓋的，外界微生物對降解效果有一定的影響。根據(jù)資料顯示，空氣中有部分細菌以及放線菌對纖維素有一定的降解效果。此外，酒糟發(fā)酵過程中的一些特殊酵母菌也可以降解纖維素。

(2)發(fā)酵時間是影響霉菌降解纖維素的效率之一。發(fā)酵時間過短，霉菌處于生長階段，對木質(zhì)素的降解作用不大，只有當霉菌進入繁殖階段，才會大量降解木質(zhì)素。但是發(fā)酵時間也不宜過長，木質(zhì)素一旦被降解得過多，其他容易消化的糖類一同被降解，會造成酒糟中的營養(yǎng)成分降低。

(3)由于檢測操作比較復(fù)雜繁瑣，不能在同一時間檢測完所有的樣品，因此進行了分批次檢測。受外界環(huán)境干擾，檢測結(jié)果也受其影響。

4 結(jié)論

通過比較兩種霉菌對酒糟中纖維素的降解試驗，初步結(jié)果表明，纖維素總體降解率不高，只有5%左右。在本試驗設(shè)定的條件下，白腐霉比康寧木霉多降解了0.67%的纖維素，且兩種菌體在20 ～30℃變化的溫度條件下更容易繁殖代謝。由于前25天纖維素降解明顯，后10天變化不大，尤其是最后5天降解幾乎不改變，可以得出本試驗中所用的酒糟纖維素的降解周期在30天以內(nèi)。

對于本試驗，影響纖維素降解率的因素有pH值、水分、溫度、碳源和氮源的供給，以及檢測方法，要進一步比較兩種菌體的降解效果，就須盡量減小這些因素的因素影響，進而取得的降解效果將更加明顯準確。