miR-127-5p對(duì)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞增殖能力影響的實(shí)驗(yàn)研究

蔡斌 鄧剛 易全勇

miR-127-5p是miRNAs家族中的一員，與其他miRNAs一樣，可以通過靶向調(diào)控靶基因來參與多種細(xì)胞分化、增殖和凋亡的生理過程。有研究表明在開角型青光眼、白內(nèi)障、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等眼科疾病中miR-127-5p存在差異表達(dá)，這些研究結(jié)果預(yù)示著miR-127-5p可能在一些眼科疾病的發(fā)生中起到重要作用[1]。Müller細(xì)胞是脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜的主要大膠質(zhì)細(xì)胞，是視網(wǎng)膜最大的細(xì)胞，細(xì)胞體位于內(nèi)核層，Müller細(xì)胞對(duì)于視網(wǎng)膜神經(jīng)元的功能和代謝有支持作用，同時(shí)也負(fù)責(zé)神經(jīng)膠質(zhì)活化、增殖，它還能經(jīng)內(nèi)界膜的裂口游離至視網(wǎng)膜表面參與形成視網(wǎng)膜前膜。筆者推測(cè)miR-127-5p可能會(huì)通過調(diào)控Müller細(xì)胞增殖能力從而影響多種眼底疾病的發(fā)生、發(fā)展，因此筆者通過miR-127-5p模擬物miR-127-5p mimics轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞來探討這一機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 主要試劑：Müller細(xì)胞完全培養(yǎng)基購(gòu)自無錫欣潤(rùn)生物科技有限公司；鏈霉素-青霉素雙抗、OPTI-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR預(yù)混液、CCK-8檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；基質(zhì)膠原液購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司；多聚甲醛、結(jié)晶紫均購(gòu)自北京科創(chuàng)經(jīng)緯科技有限公司；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒、Propidium Iodide流式細(xì)胞儀檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海艾博抗貿(mào)易有限公司。細(xì)胞：大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞購(gòu)自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司；miR-127-5p mimics購(gòu)自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞置于Müller細(xì)胞完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入10%FBS、100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的鏈霉素，放入37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，在無菌條件下用0.25%胰酶消化，在顯微鏡下觀察到80%的細(xì)胞形態(tài)開始變圓時(shí)，取2ml細(xì)胞培養(yǎng)基加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中終止消化，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×106個(gè)/ml，備用。

1.3 分組和轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)后的大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，其中實(shí)驗(yàn)組分為3個(gè)亞組分別轉(zhuǎn)染 10、30、100μM 3 種濃度的 miR-127-5p mimics進(jìn)行細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染miR-127-5p陰性對(duì)照劑miR-127-5p-NC。吸取200pmol miR-127-5p mimics（對(duì)照組為miR-127-5p-NC）加入 1.5ml的無菌EP離心管中，再加入無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM 1ml，充分混勻后加入轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX 12μl，混勻后室溫靜置20min。吸取混合液緩慢滴加到Müller細(xì)胞培養(yǎng)板中。48h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞常規(guī)消化、離心、重懸后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，每孔細(xì)胞數(shù)2 000個(gè)，每組處理細(xì)胞設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，放于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。分別于6h、第2、3、4、5天加入20%CCK-8，37°C避光孵育2h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm時(shí)的吸光度（OD）值來表示細(xì)胞增殖能力。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 細(xì)胞侵襲、遷移能力檢測(cè) 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。分為遷移小室實(shí)驗(yàn)和侵襲小室實(shí)驗(yàn)，前者無基質(zhì)膠而后者有基質(zhì)膠。取結(jié)晶紫0.05g溶于甲醇制成0.5%的結(jié)晶紫溶液，用PBS溶液1（:5～8）制成0.1%的結(jié)晶紫染液。將BD matrigel和無血清培養(yǎng)基以1:8比例稀釋，吸取80μl加入Trans well的上室中，放置于培養(yǎng)箱中至少2h。將細(xì)胞消化、離心、無血清重懸、并稀釋成5×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。Transwell板中加入500μl含20%FBS的完全培養(yǎng)基，將小室放入板中。在Transwell小室中加入200μl的細(xì)胞懸液，將Transwell板37℃下于CO2（含量5%）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。將小室取出，用PBS洗去培養(yǎng)基，結(jié)晶紫染色10min；自來水將表面的結(jié)晶紫洗除干凈，用棉簽將上室中接種側(cè)的細(xì)胞擦除干凈，最后使用奧林巴斯BX51顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞的侵襲、遷移能力，并采用Image J軟件對(duì)發(fā)生侵襲、遷移行為的大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.6 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。細(xì)胞懸液處理同上，取 100μl細(xì)胞懸液、5μl的 7-AAD 及 5μl的FITC Annexin V充分混勻，置于室溫（20～25℃）避光15min，加400μl Binding Buffer在1h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度miR-127-5p mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞OD值的比較 與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染10、30、100μM miR-127-5p mimics組中大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞OD值均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），同時(shí)這3種濃度組間OD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同濃度miR-127-5p mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞OD值的比較

2.2 兩組細(xì)胞侵襲能力比較 陰性對(duì)照組、30μM的miR-127-5p mimics實(shí)驗(yàn)組（下同）細(xì)胞侵襲數(shù)目分別為（29.19±3.42）、（14.59±2.38）個(gè)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲數(shù)目較陰性對(duì)照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 1（插頁）。

2.3 兩組細(xì)胞遷移能力比較 實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組細(xì)胞遷移的數(shù)目分別為（29.68±3.28）、（58.19±5.42）個(gè)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移數(shù)目較陰性對(duì)照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 2（插頁）。

2.4 兩組細(xì)胞凋亡率的比較 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率（26.11±2.13）%，明顯高于陰性對(duì)照組的（4.19±0.76）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3（插頁）。

3 討論

miR-127-5p近年來被發(fā)現(xiàn)在多種疾病中的表達(dá)水平與正常組織比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)miR-127-5p表達(dá)水平的失調(diào)也參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展過程[2]。研究表明miR-127-5p對(duì)于生理活動(dòng)的調(diào)控主要是通過調(diào)控細(xì)胞的增殖能力，如miR-127-5p可以通過靶向結(jié)合SETD8基因調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞系的增殖能力[3]。在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中，miR-127-5p的表達(dá)水平顯著低于正常關(guān)節(jié)軟骨組織，說明miR-127-5p過表達(dá)可以提高軟骨細(xì)胞的增殖能力[4-5]。在一系列肝癌細(xì)胞系中，miR-127-5p的表達(dá)水平顯著高于正常細(xì)胞系，而在乳腺癌細(xì)胞中miR-127-5p的表達(dá)水平顯著下調(diào)[2]。在眼科類疾病中同樣也發(fā)現(xiàn)miR-127-5p具有表達(dá)水平差異，例如在視網(wǎng)膜發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)的一系列具有表達(dá)差異的miRNAs中就有miR-127-5p的存在，在開角型青光眼與白內(nèi)障患者中發(fā)現(xiàn)的16種具有差異表達(dá)的miRNAs中也包含miR-127-5p[6]，在糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變組織中，存在17種差異表達(dá)的miRNAs，而miR-127-5p也正是差異表達(dá)的miRNAs中的一員[7]。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道可知，miRNAs在目標(biāo)組織的異常表達(dá)通常暗示著該miRNAs在該組織中可能存在調(diào)控作用[2]。在本實(shí)驗(yàn)中筆者選用大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞為研究對(duì)象，Müller細(xì)胞是視網(wǎng)膜中非常重要的一類膠質(zhì)細(xì)胞，Müller細(xì)胞不僅在正常的視網(wǎng)膜功能中有重要作用，在各類型的視網(wǎng)膜變性疾病中Müller細(xì)胞同樣具有重要作用[8]，同時(shí)在特發(fā)性黃斑前膜的形成過程中，視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞發(fā)揮重要作用，研究表明在大多數(shù)特發(fā)性黃斑前膜組織中都具有谷氨酰胺合成酶免疫反應(yīng)性，這表明特發(fā)性黃斑前膜的組成細(xì)胞可能主要起源于Müller細(xì)胞，因?yàn)楣劝滨０泛铣擅傅拿庖叻磻?yīng)性主要表達(dá)在Müller細(xì)胞中[9-10]。此外，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β可以通過調(diào)控視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)化參與特發(fā)性黃斑前膜的形成[11]。這些研究證據(jù)充分證明Müller細(xì)胞的活性在特發(fā)性黃斑前膜的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，因此為了探究miR-127-5p表達(dá)水平顯著下調(diào)在特發(fā)性黃斑前膜中的作用，筆者使用Müller細(xì)胞作為研究模型，通過細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)以探究miR-127-5p對(duì)于Müller細(xì)胞行為的影響。

本研究采用 10、30、100μM 的 miR-127-5p mimics轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，并檢測(cè)這3種濃度的miR-127-5p mimics對(duì)于大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的增殖能力的影響，結(jié)果顯示miR-127-5p mimics轉(zhuǎn)染后可以顯著抑制大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的增殖能力，該結(jié)果與miR-127-5p在其他細(xì)胞中對(duì)于細(xì)胞增殖能力的調(diào)控作用一致，如在肝癌細(xì)胞系中，miR-127-5p可以通過靶向結(jié)合BLVRB基因抑制其表達(dá)水平從而抑制肝癌細(xì)胞系的增殖能力，在乳腺癌細(xì)胞中，miR-127-5p可以通過抑制靶基因BCL6表達(dá)水平從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力[7]。此外，筆者還進(jìn)一步檢測(cè)了miR-127-5p表達(dá)水平升高后對(duì)于大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的其他細(xì)胞行為的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-127-5p表達(dá)水平升高之后，大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的侵襲能力和遷移能力均受到顯著抑制，該結(jié)果同樣與miR-127-5p在其他細(xì)胞侵襲和遷移中的作用類似[7]，證明miR-127-5p表達(dá)水平升高能抑制大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的增殖能力。此外，筆者采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-127-5p表達(dá)水平升高后，大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞凋亡率增加，證明miR-127-5p表達(dá)水平升高不僅能抑制大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)還在一定程度上促進(jìn)了視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的凋亡。

總之，本研究證實(shí)了miR-127-5p表達(dá)水平升高可以抑制大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，并促進(jìn)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞的凋亡。miR-127-5p可能是治療或者阻止特發(fā)性黃斑前膜發(fā)展的潛在靶點(diǎn)。