穿心蓮內酯延緩急性胰腺炎相關腎損傷的代謝組學研究

邵國建 王雷 鄭約楠 張一帆 邵玲就 司亞晨

1溫州市中心醫(yī)院腎內科，溫州 325000；2海軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院消化內科，上海 200433；3海軍軍醫(yī)大學研究生院，上海 200433

急性腎損傷是AP常見的臨床并發(fā)癥，AP并發(fā)急性腎損傷患者的病死率是未并發(fā)急性腎損傷患者的10倍以上[1-2]。由此可見，AP相關腎損傷嚴重制約AP的救治成功率。AP誘發(fā)的炎癥相關的瀑布級聯(lián)效應以及血流動力學紊亂，被認為是引起急性腎損傷的可能機制，其中相關的細胞因子(如IL-6、TNF-α等)、急性時相反應蛋白(如C反應蛋白、血清淀粉樣物質A等)以及降鈣素原可能為AP相關腎損傷的早期預測因子[2-3]。穿心蓮內酯(andrographolide，AG)作為植物中藥穿心蓮的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、調節(jié)免疫等作用，是一種潛在的肝保護劑[4]。此外，既往研究還提示AG不僅可以通過保護胰島免受氧化損傷改善胰島素抵抗，降低血糖，還可以通過減輕氧化應激、炎癥等抑制糖尿病腎病的進展[5-6]。然而AG是否對AP以及AP相關腎損傷存在保護作用目前尚不清楚。本研究旨在探討AG對AP相關腎損傷的影響，并利用代謝組學方法分析潛在機制。

材料與方法

一、材料

8周雄性C57BL/6小鼠(體重20～25 g)購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司；AG總酯磺化物購于江西青峰制藥有限公司；左旋精氨酸以及脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)均購于上海西格瑪-奧德里奇公司；生物化學指標檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所有限公司。

二、動物模型建立及分組

將32只小鼠按數(shù)字表法隨機分為對照組、AP組、AG治療組及AG對照組，每組8只。對照組給予等體積生理鹽水腹腔注射；AP組腹腔注射左旋精氨酸2 g/kg聯(lián)合LPS 100 μg/kg制備AP模型，每天1次，連續(xù)3 d；AG治療組在制模前8 h靜脈注射AG注射液1 ml，連續(xù)3 d；AG對照組在給予生理鹽水腹腔注射前8 h靜脈注射AG注射液1 ml，連續(xù)3 d。AG注射液使用劑量參考賈金虎等[7]應用AG總酯磺化物治療膿毒癥的臨床研究中使用的劑量，即5 mg·kg-1·d-1，換算成小鼠使用的劑量為45.5 mg·kg-1·d-1，約1 mg/d，故本研究采用劑量為1 g/L的AG注射液1 ml/d。

三、標本收集

干預完成24 h后，對所有小鼠行眼內眥靜脈取血，4℃冰箱靜置40 min后，以轉速3 000 r/min、離心半徑15 cm離心5 min，取血清置于-80℃冰箱保存。取血后處死小鼠，行心臟灌流，取胰腺組織和雙側腎臟。取一半胰腺組織及左側腎臟置于甲醛溶液中固定保存。另一半胰腺組織及右側腎臟液氮速凍后置于-80℃冰箱中保存。

四、血清淀粉酶、肌酐、尿素氮水平和胰腺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性檢測

采用碘-淀粉比色法檢測血清淀粉酶活性；采用ELISA試劑盒檢測血清肌酐及尿素氮水平。取出-80℃冰箱儲存的胰腺組織，按重量體積比1∶19加入勻漿介質制備成5%組織勻漿，采用比色法檢測胰腺組織MPO活性。

五、胰腺及腎組織病理學分析

取甲醛固定的胰腺及腎組織，常規(guī)行病理學檢查。每張切片觀察5個視野，由兩位病理醫(yī)師進行讀片并評分。參照Schmidt等[8]方法對胰腺病理進行半定量評分：0分，正常胰腺；1分，小葉間區(qū)域性水腫，腺管邊緣炎癥，實質出血<25%，無明顯實質壞死；2分，小葉間彌漫性水腫，實質炎癥及出血<50%，點狀實質壞死<20%；3分，腺泡腫脹，小葉間隙增大，實質炎癥及出血<75%，小葉缺失<50%；4分，明顯小葉分離，實質炎癥及出血>75%，小葉缺失>50%。參照Zhou等[9]方法對腎臟病理進行半定量評分：0分，正常腎小管；1分，僅有腎小管上皮細胞變性而無壞死；2分，近端腎小管上皮細胞變性、壞死、增生、管腔擴張、蛋白管型、間質淋巴細胞浸潤等改變≤25%；3分，上述改變≤50%；4分，上述改變≤75%；5分，上述改變>75%。

六、腎組織代謝組學分析

取出-80℃冰箱儲存的腎組織，取皮髓交界部分，稱取50 mg加入含內標(二氯苯丙氨酸)的甲醇溶液1 ml，加入碾磨珠，4℃、70 Hz碾磨120 s，再置入4℃離心機中，以轉速12 000 r/min、離心半徑15 cm離心10 min，取上清200 μl上樣。余上清每個取10 μl混合成質量控制液(quality control, QC)，渦旋后取200 μl上樣。

采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間串聯(lián)質譜(ultra-high-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time-of-flight mass spectro-metry, UHPLC-Q-TOF/MS)系統(tǒng)進行代謝組學分析。使用美國Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀和Agilent 6538高分辨四級桿-飛行時間串聯(lián)質譜儀。色譜柱使用ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)。流動相包括0.1%甲酸(A)和混合了0.1%甲酸的乙腈(B)。優(yōu)化的超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)洗脫條件為：0～2 min，5% B；2～10 min，5%～15% B；10～14 min，15%～30% B；14～17 min，30%～95% B；17～19min，95% B；平衡時間為6 min；流速為0.4 ml/min；進樣量為2 μl；自動進樣器溫度保持4℃。電噴霧離子源采用正、負離子模型。質譜具體參數(shù)：毛細管電壓，正離子模式下3 500 V，負離子模式下4 000 V；干燥器流速11 L/min；氣體溫度350℃；霧化器壓力45 psi；fragmentor電壓120 V；skimmer電壓60 V。質譜的采集范圍50～1 100 m/z。參比離子：正離子模式下121.0509，922.0098；負離子模式下112.98558700，1033.98810900。使用串聯(lián)質譜進一步分析潛在的生物標志物，并將碰撞能量設置為10～50 eV。

七、數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計學處理

原始數(shù)據(jù)通過Agilent MassHunter軟件，由UHPLC-MS格式轉換為通用數(shù)據(jù)格式(mzdata)文件。排除同位素干擾，閾值設定為0.1%。用XCMS(http://metlin.scripps.edu/download/)程序對齊時域數(shù)據(jù)的峰值、峰值強度的提取和自動積分。保留時間比對和峰積分以生成可視數(shù)據(jù)矩陣?；?0%原則過濾離子后，將每個樣品中檢測到的離子標準化為峰面積的總和，以校正質譜響應偏移，獲得代謝物的相對強度。將包括樣品名稱、保留時間、質荷比和標準化離子強度的三維數(shù)據(jù)矩陣居中和帕累托縮放后，導入SIMCA-P程序，以進行多變量統(tǒng)計分析。采用主成分分析(principal component analysis, PCA)和偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)進行排列測試以評估模型的質量，生成變量重要性投影(variable importance in the projection, VIP)， 選擇VIP>1.0的代謝物用于進一步分析。

結 果

一、各組小鼠血清淀粉酶、肌酐、尿素氮水平及胰腺組織MPO活性比較

AP組血清淀粉酶、肌酐、尿素氮水平及胰腺組織MPO活性顯著高于對照組，AG治療組又顯著低于AP組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，而對照組與AG對照組間的差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

二、各組小鼠胰腺及腎組織病理評分比較

對照組及AG對照組小鼠胰腺組織結構基本正常；AP組胰腺表現(xiàn)為小葉間隙增大，小葉間炎細胞浸潤明顯，部分腺泡細胞出現(xiàn)壞死，細胞核固縮；AG治療組僅表現(xiàn)為部分小葉水腫及小葉間隙輕度增大(圖1A～1D)。對照組、AP組、AG治療組和AG對照組小鼠胰腺組織病理評分分別為(0.20±0.12)、(2.70±0.26)、(1.40±0.19)、(0.10±0.10)分，AP組顯著高于對照組，AG治療組顯著低于AP組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，而AG對照組與對照組間的差異無統(tǒng)計學意義。

表1 各組小鼠血清淀粉酶、肌酐、尿素氮水平及胰腺組織MPO活性比較

注：MPO為髓過氧化物酶；AP為急性胰腺炎；AG為穿心蓮內酯。與對照組比較，aP<0.05；與AP組比較，bP<0.05

對照組及AG對照組小鼠腎組織結構基本正常；AP組表現(xiàn)為腎小管上皮壞死，上皮細胞排列紊亂，細胞核丟失或空泡化，間質部分炎細胞浸潤；AG治療組僅表現(xiàn)為部分腎小管上皮細胞核丟失或空泡化(圖1E～1H)。對照組、AP組、AG治療組和AG對照組小鼠腎組織病理評分分別為(0.30±0.12)、(3.00±0.35)、(1.70±0.26)、(0.20±0.20)分，AP組顯著高于對照組，AG治療組顯著低于AP組，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，而AG對照組與對照組間的差異無統(tǒng)計學意義。提示本研究給予的AG劑量對腎組織無毒性。

三、腎組織代謝組學分析

正、負離子模式下的PCA結果提示，對照組、AP組和AG治療組之間存在一定差異(圖2A、2B)。進一步行正、負離子模式下的PLS-DA篩選差異代謝物，平面圖顯示AP組與對照組顯著分開，而AG治療組與對照組接近(圖2C、2D)。通過VIP>1.0、P<0.05的篩選，共獲得31個代謝物可能與AG治療AP相關腎損傷的作用相關(表2)。這31個代謝物主要參與氨基酸代謝和脂肪酸代謝，少部分還參與糖代謝、核苷酸代謝、維生素代謝以及膽汁酸代謝。其中硫酸吲哚酚作為常見的小分子尿毒癥毒素，在AP相關腎損傷時顯著升高，而AG治療則降低了硫酸吲哚酚的生成。此外，馬尿酸、甲基馬尿酸、4-氨基馬尿酸、對甲酚硫酸鹽、對甲酚葡萄糖醛酸等尿毒癥毒素在AP相關腎損傷時也顯著升高，給予AG治療后這些代謝物水平下降。提示AG可能通過改變腎組織代謝物水平從而起到治療作用。

圖1 對照組、AP組、AG治療組及AG對照組胰腺組織(1A～1D)和腎組織(1E～1H)病理改變(蘇木精-伊紅染色 ×400)

圖2 正、負離子模式下對照組、AP組及AG治療組的PCA(2A、2B)和PLS-DA(2C、2D)平面圖

表2 AG治療AP相關腎損傷的差異代謝物及其代謝途徑

注：AG為穿心蓮內酯；AP為急性胰腺炎

討 論

代謝組學作為反應疾病內環(huán)境或者外源性刺激與內源性代謝物之間關系的一種方法，近年來被廣泛應用于各種疾病以及藥物治療研究中。本研究利用代謝組學發(fā)現(xiàn)共有31個差異代謝物與AP相關腎損傷以及AG的治療作用相關，這些代謝物主要參與氨基酸和脂肪酸代謝。

在氨基酸代謝中，硫酸吲哚酚、對甲酚硫酸鹽、馬尿酸、甲基馬尿酸、4-氨基馬尿酸等尿毒癥毒素均在AP相關腎損傷時明顯升高，而經(jīng)過AG治療后發(fā)生回調。硫酸吲哚酚作為常見的小分子尿毒癥毒素，其主要是由色氨酸在肝臟或腸道微生物的硫酸化作用下產(chǎn)生，并且由尿液排出[10]。既往研究顯示，硫酸吲哚酚水平不僅在急性腎損傷時升高，而且還可以增強炎癥遞質介導的血管內皮細胞損傷，增加心血管疾病風險[11-12]。硫酸吲哚酚在AP相關腎損傷時顯著升高，究其原因，一可能是由于腎功能減損，硫酸吲哚酚隨尿液排出減少；二可能是由于腸道屏障功能受損，腸道菌群失調，色氨酸在微生物途徑下產(chǎn)生硫酸吲哚酚等毒素增多。AP時TNF-α可以增加腸道通透性，促進上皮細胞的細菌易位，引起腸道菌群失調，同時影響腸道淋巴組織功能，炎癥遞質通過腹腔淋巴循環(huán)侵入全身循環(huán)，可誘導終末器官衰竭[13]。因此，可以推測AP誘導的腸道屏障功能受損使腸道菌群失調，增強了色氨酸的微生物途徑，使硫酸吲哚酚等多種毒素產(chǎn)生增加。AG作為一種具有抗菌活性的天然化合物，可能通過調節(jié)腸道菌群，修復腸道屏障，從而對AP相關腎損傷起到保護作用。

在脂肪酸代謝中，所有肉堿類物質在AP相關腎損傷時均存在下調，而AG治療則可以使這些代謝物水平回升。有研究發(fā)現(xiàn)肉堿在順鉑誘導的腎損傷以及缺血再灌注誘導的急性腎損傷中起到保護作用[14-15]，提示肉堿在AP相關腎損傷時同樣發(fā)揮保護作用。肉堿作為脂肪酸β-氧化的關鍵物質，其在脂肪酸從線粒體膜間轉移至線粒體基質的過程中發(fā)揮重要作用。既往研究提示脂肪酸β-氧化受損會引起腎臟纖維化加重，而修復脂肪酸β-氧化可以延緩腎臟疾病的進展[16]。因此推測AG可能通過提高肉堿水平，增強脂肪酸β-氧化，從而在AP相關腎損傷時起到保護作用。脂肪酸代謝中的溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholines，LPCs)在AP相關腎損傷中均存在下調，而在AG治療后回升。有研究發(fā)現(xiàn)在慢性腎臟疾病和血液透析患者中，隨著腎臟疾病的進展，LPCs水平不斷降低，且LPCs水平還與患者的預后生存相關，證實其在腎臟中的保護作用[17-18]。因此，LPCs的水平可能也與AP相關腎損傷的嚴重程度相關，并且有可能成為預測疾病嚴重程度的指標。既往還有研究提示，適當劑量的LPCs可能通過降低炎癥遞質IL-1β從而減輕LPS誘導的膿毒癥損傷[19]，推測AG可能通過提高LPCs水平，減少IL-1β等炎癥遞質，從而減輕AP相關腎損傷。

既往關于AG引起的急性腎損傷在臨床中時有報道[20-21]，動物實驗也有提及AG具有腎毒性[22]。但本研究結果顯示，AG對AP相關腎損傷具有保護作用，究其原因，可能與AG結合的鹽類化合物性質不同有關。在AG腎毒性動物實驗中所用到的化合物為亞硫酸氫鈉AG，與本實驗用到的AG總酯磺化物不同，這兩種化合物在臨床對應的藥物分別是蓮必治注射液和喜炎平注射液。臨床分析AG不同鹽類注射劑的不良反應結果表明，蓮必治注射液腎損害發(fā)生率高，而喜炎平注射液幾乎不引起腎損害[23]，因此在臨床中應當避免對腎功能不全患者使用蓮必治注射液。AG不同鹽類注射劑的安全性以及臨床不良反應值得進一步分析。

總之，本研究結果提示AG可能通過改變代謝物的水平對AP相關腎損傷起到保護作用，但其中的具體作用機制有待后續(xù)更深入的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突