閔捷 曹麗莉 沈彬彬 周瑜 黎亮 周俊
1浙江省嘉興市第一醫(yī)院(嘉興學(xué)院附屬第一醫(yī)院)肝膽外科,嘉興 314000;2浙江省榮軍醫(yī)院外科,嘉興 314000
非編碼RNA包括長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, lncRNA)和微小RNA (micro RNA,miR),這兩種RNA通過不同的分子機(jī)制相互作用參與腫瘤的發(fā)生[1]。研究證實,lncRNA X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本(X-inactive specific transcript,XIST)作為癌基因,在肺腺癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌和膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá),促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移[2-6],而miR-101則作為抑癌基因在胰腺癌組織中呈低表達(dá),可通過靶向抑制Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶2(rhoassociated coiled coil forming protein kinas,ROCK2)減弱胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力[7]。zeste基因增強(qiáng)子同源物2(enhancer of zeste homolog2, EZH2)是miR-101的下游靶向基因,與miR-101的結(jié)合靶點為3′-UTR區(qū),其存在7個互補(bǔ)堿基。既往研究報道[8],lncRNA XIST和miR-101在宮頸癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),認(rèn)為lncRNA XIST可通過海綿樣吸附作用,競爭性與miR-101結(jié)合,抑制miR-101的調(diào)控作用。然而有關(guān)lncRNA XIST與miR-101兩者相互作用對胰腺癌的影響報道較少。本研究旨在探討lncRNA XIST與miR-101/EZH2對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移的影響及其與臨床病理特征的關(guān)系,以期為胰腺癌的早期診斷和治療靶點提供參考。
收集2010年7月至2018年9月間浙江省嘉興市第一醫(yī)院肝膽胰外科手術(shù)切除且病理確診的90例胰腺癌患者的癌組織和匹配的癌旁正常胰腺組織(距離手術(shù)切緣>3 cm),其中男性54例,女性36例,年齡38~69歲,中位年齡48歲。胰頭癌58例,胰體尾癌32例;高分化30例,中分化39例,低分化21例;直徑<2 cm 32例,>2 cm 58例;腫瘤分期Ⅰ+Ⅱ期39例、Ⅲ+Ⅳ期51例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例,未轉(zhuǎn)移62例。術(shù)前患者均未接受化療、放療等輔助治療。所有標(biāo)本取下后立即置-196℃液氮中保存。
應(yīng)用Trizol抽提胰腺癌組織和癌旁組織RNA,應(yīng)用實時定量RT-PCR方法檢測lncRNA XIST及miR-101的表達(dá)量,RNA逆轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明書操作,逆轉(zhuǎn)錄的cDNA行實時熒光定量PCR。反應(yīng)條件:95℃ 5 min,95℃ 10 s、60℃ 30 s,40個循環(huán);溶解曲線:95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s。XIST正向引物序列5′-AATGGTGGTAGGAGGGAGGA-3′,反向引物序列5′-CAAGGGGAATGAACACGAGG-3′;miR-101正向引物序列5′-CGGCGGGGAGAAATTATCCT-3′,反向引物序列5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;內(nèi)參U6正向引物序列5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′,反向引物序列5′-AATGCTATCACCTCCCCTGTGT-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計并合成。通過PCR儀器自帶軟件獲取擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct值,采用公式2-△△Ct計算mRNA相對表達(dá)量。每個樣品設(shè)3個復(fù)管,取均值。
PANC1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心,常規(guī)復(fù)蘇、傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞,以每孔5×105個細(xì)胞接種于6孔板。將PANC1細(xì)胞分為lncRNA XIST表達(dá)抑制組(sh-XIST組)、shRNA對照組(sh-control組)、miR-101過表達(dá)組(miR-101組)和空質(zhì)粒對照組(miR-control組),分別感染plko-lncRNA XIST-shRNA、plko-control-shRNA、plko-control miR和plko-miR-101慢病毒。所有慢病毒的質(zhì)粒載體由本課題組自行構(gòu)建,再由上海捷瑞生物有限公司進(jìn)行病毒包裝,病毒∶細(xì)胞為100∶1。感染細(xì)胞24 h后更換培養(yǎng)基,用含1 μg/ml嘌呤霉素的DMEM培養(yǎng)液處理細(xì)胞24 h以殺死未被感染的細(xì)胞,取存活并感染成功的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)及傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞,采用上述實時熒光定量PCR法檢測各組PANC1細(xì)胞lncRNA XIST和miR-101表達(dá)水平。
取sh-XIST組、sh-control組、miR-control組和miR-101組第3代PANC1細(xì)胞,以每孔5×104個細(xì)胞接種于96孔板,分別培養(yǎng)0、12、48、72 h,到時間點時每孔加入20 μl CCK-8(日本株式會社)繼續(xù)孵育2 h,上酶標(biāo)儀在波長450 nm處測定每孔吸光度值(A450值),繪制細(xì)胞生長曲線。
選用sh-XIST組、sh-control組、miR-control組和miR-101組第3代PANC1細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)液調(diào)整為1×106/ml個細(xì)胞懸液,在Transwell小室(美國Corning公司)的上室加入100 μl細(xì)胞溶液,下室加入含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液500 μl,培養(yǎng)24 h后取出小室隔膜,用棉簽輕輕擦去隔膜上室面未穿膜細(xì)胞,用4%多聚甲醛室溫固定隔膜30 min,PBS洗滌3次,1%結(jié)晶紫染液染色15 min,自來水洗滌多余的結(jié)晶紫染液,室溫干燥,在顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。
收集sh-XIST組、sh-control組、miR-control組和miR-101組對數(shù)生長期PANC1細(xì)胞,采用RIPA細(xì)胞裂解液裂解組織,抽取總蛋白。采用BCA試劑盒定量蛋白后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測EZH2表達(dá)水平,以Tubulin為內(nèi)參。EZH2單克隆抗體和HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗均購自美國Santa Cruz公司,EZH2工作濃度為1∶2 000,二抗工作濃度為1∶2 500。采用ECL發(fā)光,X片曝光、顯影、定影。應(yīng)用Bio-Rad公司的全自動凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶,以目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比表示蛋白相對表達(dá)量。
將sh-XIST組、sh-control組、miR-control組和miR-101組PANC1細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,以3×106個/100 μl密度分別接種于Balb/c裸鼠(20 g,購于北京維通利華實驗動物有限公司)腋下脂肪墊,100 μl/只。在SPF級動物房中飼養(yǎng)小鼠,每隔2 d測量腫瘤長徑和寬徑,采用體積[V(mm3)]=1/2×長(mm)×寬(mm)×寬(mm)計算腫瘤體積。
生物信息學(xué)研究顯示lncRNA XIST和miR-101存在7個互補(bǔ)的堿基,miR-101與EZH23′UTR區(qū)域存在7個互補(bǔ)堿基[8],依據(jù)miR-101與它們的結(jié)合位點,設(shè)計野生型lncRNA XIST(XIST-WT)和野生型EZH2-3′-UTR(EZH2-WT)以及缺失miR-101結(jié)合區(qū)域的lncRNA XIST突變體(XIST-Mut)和EZH2-3′-UTR突變體(EZH2-Mut)序列,并構(gòu)建熒光素酶報告載體(山東維真生物有限公司構(gòu)建)。分別將XIST-WT、XIST-Mut、EZH2-WT、EZH2-Mut熒光素酶報告載體轉(zhuǎn)染miR-101-control組及miR-101組PANC1細(xì)胞48 h,采用雙熒光素酶報告基因試劑盒(美國Promega公司)檢測熒光素酶活性。
胰腺癌組織及其癌旁正常胰腺組織lncRNA XIST表達(dá)量分別為2.89±0.42和1.12±0.22,癌組織顯著高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.948,P<0.05)。胰腺癌組織及其癌旁正常胰腺組織miR-101表達(dá)量分別為0.32±0.12和1.25±0.22,癌組織顯著低于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.118,P<0.05)。sh-XIST組PANC1細(xì)胞lncRNA XIST表達(dá)水平較sh-control組顯著下調(diào)(0.34±0.18比1.21±0.27),miR-101組PANC1細(xì)胞miR-101表達(dá)水平較miR-control組顯著上調(diào)(2.94±0.31比1.54±0.29),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為3.801、3.710,P值均<0.05)。
胰腺癌組織lncRNA XIST、 miR-101表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),即胰腺癌的分化程度越高、TNM分期越高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織lncRNA XIST水平顯著升高,miR-101水平顯著降低,而它們與病理類型和腫瘤大小無明顯相關(guān)性(表1)。
表1 胰腺癌組織lncRNA XIST和miR-101表達(dá)水平與腫瘤病理特征的關(guān)系
注:lncRNA XIST為長鏈非編碼RNA X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本
sh-control組、sh-XIST組、miR-control組和miR-101組PANC1細(xì)胞的生長曲線見圖1,sh-control組和sh-XIST組48 h時A450值分別為1.45±0.21、0.89±0.15;72 h時分別為1.98±0.24、1.21±0.20,sh-XIST組較sh-control組的細(xì)胞增殖能力明顯下降(t值分別為3.148、3.290); miR-control和miR-101組48 h時A450值分別為1.39±0.18、0.81±0.19;72 h分別為1.87±0.21、1.11±0.17,miR-101組較miR-control組的細(xì)胞增殖能力顯著下降(t值分別為3.206、3.409),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。
sh-control組、sh-XIST組、miR-control組和miR-101組細(xì)胞遷移數(shù)量分別為(74.25±6.79)、(29.11±5.17)、(61.27±5.19)、(20.47±4.58)個細(xì)胞/200倍視野(圖2), sh-XIST組較sh-control組、miR-101組較miR-control組穿膜細(xì)胞數(shù)量均顯著下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為4.119、4.387,P值均<0.05)。
sh-XIST組較sh-control組、miR-101組較miR-control組裸鼠種植瘤體積均明顯縮小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F值分別為2.910、2.971,P值均<0.05,圖3)。
轉(zhuǎn)染XIST-WT的miR-101組PANC1細(xì)胞的熒光素酶活性較轉(zhuǎn)染 XIST-WT的miR-control組細(xì)胞顯著下調(diào)(0.35±0.15比1.23±0.25,t=3.098,P<0.05);轉(zhuǎn)染XIST-Mut的 miR-control組和miR-101組PANC1細(xì)胞的熒光素酶活性分別為1.10±0.15和0.99±0.17,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.275,P>0.05),證明miR-101是lncRNA XIST的結(jié)合靶點(圖4)。
圖1 sh-control組、sh-XIST組(1A)與miR-control組、miR-101組(1B)PANC1細(xì)胞的生長曲線
圖2 sh-control組(2A)、sh-XIST組(2B)、miR-control組(2C)和miR-101組(2D)PANC1穿膜細(xì)胞(結(jié)晶紫染色 ×200)
圖3 sh-control組、sh-XIST組(3A)與miR-control組、miR-101組(3B)裸鼠種植瘤體積
圖4 lncRNA XIST和miR-101的靶向關(guān)系
轉(zhuǎn)染EZH2-WT的miR-101組PANC1細(xì)胞的熒光素酶活性較轉(zhuǎn)染 EZH2-WT的miR-control組細(xì)胞顯著下調(diào)(0.39±0.12比0.94±0.15,t=3.001,P<0.05);轉(zhuǎn)染EZH2-Mut的miR-control組和miR-101組PANC1細(xì)胞的熒光素酶活性分別為0.98±0.10和0.95±0.13,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.411,P>0.05),證明EZH2是miR-101的下游結(jié)合靶點。
sh-control組、sh-XIST組、miR-control組、miR-101組細(xì)胞EZH2蛋白相對表達(dá)量分別為1.08±0.14、0.24±0.09、1.00±0.11和0.30±0.13(圖5)。與sh-control和miR-control組比,sh-XIST組和miR-101組細(xì)胞EZH2蛋白表達(dá)降低(t值分別為3.019、3.120,P值均<0.05),提示lncRNA XIST靶向調(diào)節(jié)miR-101/EZH2蛋白的表達(dá)。
圖5 sh-control組(1)、sh-XIST組(2)、miR-control組(3)、miR-101組(4)細(xì)胞EZH2表達(dá)
lncRNA是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子,但可以在多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)[9-10],與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。lncRNA XIST是目前已經(jīng)鑒定出的lncRNA成員之一,具有多個生物學(xué)功能,包括調(diào)節(jié)染色體沉默、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生和化療耐藥性等[11-13]。lncRNA XIST通過作用于不同的分子參與了腫瘤如結(jié)腸癌、肺癌和宮頸癌等的發(fā)生和發(fā)展。本課題組曾采用非編碼RNA測序發(fā)現(xiàn)lncRNA XIST和miR-101在胰腺癌組織中呈現(xiàn)異常表達(dá)(待發(fā)表)。本研究通過熒光定量PCR法驗證了lncRNA XIST在胰腺癌組織顯著上調(diào),而miR-101在胰腺癌組織顯著下調(diào),進(jìn)一步分析顯示,胰腺癌的分化程度越高、TNM分期越高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中l(wèi)ncRNA XIST表達(dá)顯著增加,而miR-101顯著下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與文獻(xiàn)報道類似[14-17]。
生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)lncRNA XIST與miR-101之間存在堿基互補(bǔ)。lncRNA主要作用方式是靶向miRNA,調(diào)控miRNA的表達(dá)水平,進(jìn)而調(diào)控下游目的基因的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示lncRNA XIST靶向與miR-101結(jié)合,導(dǎo)致游離miR-101的水平下調(diào)。沉默lncRNA XIST表達(dá)可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力,而過表達(dá)miR-101則可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力,體內(nèi)增殖實驗也進(jìn)一步證實了體外細(xì)胞實驗的結(jié)果。
通過生物信息學(xué)檢索,顯示EZH2是miR-101的靶基因。EZH2基因編碼的是一種組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶,參與DNA甲基化從而抑制其他基因轉(zhuǎn)錄,EZH2也可甲基化組蛋白H3第27位賴氨酸。EZH2的甲基化活性促進(jìn)異染色質(zhì)的形成從而使基因沉默,是PRC2復(fù)合物的組分之一[18-20]。EZH2突變或過表達(dá)與多種類型癌癥相關(guān),如乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤和膀胱癌等[21]。本研究采用熒光素酶報告基因檢測,結(jié)果顯示沉默胰腺癌PANC1細(xì)胞lncRNA XIST表達(dá),或者過表達(dá)miR-101,均導(dǎo)致EZH2蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),提示腫瘤組織中l(wèi)ncRNA XIST水平升高,使其與更多的miR-101結(jié)合,導(dǎo)致游離的miR-101水平下降,進(jìn)而導(dǎo)致癌基因EZH2蛋白水平升高,促進(jìn)了胰腺癌的發(fā)生。
綜上所述, lncRNA XIST與miR-101表達(dá)異常參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程,lncRNA XIST通過miR-101/EZH2軸調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲力,進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突