柴胡總多糖對內(nèi)毒素血癥大鼠肺損傷的影響*

河北中醫(yī)學院中西醫(yī)結(jié)合學院

張 冬 張 豪△ 賁 瑩 杜澍金 方 倩 賀 明 張鳳華(石家莊 050200)

提要 目的：研究柴胡總多糖對脂多糖(LPS)誘導的內(nèi)毒素血癥(ETM)大鼠肺損傷的影響。 方法：選取健康雄性清潔級SD大鼠40只，遵照隨機數(shù)字表法，每組8只，共分為5組：對照組(生理鹽水)、模型組(LPS)、地塞米松組(陽性藥組)、柴胡總多糖低劑量組(LPS+柴胡總多糖低劑量)、柴胡總多糖高劑量組(LPS+柴胡總多糖高劑量)。尾靜脈注射LPS ( 4 mg/kg) 建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型，1 h后分別灌胃給予柴胡總多糖(50 mg/kg、150 mg/kg)，地塞米松(2 mg/kg)。測定對照組和模型組血液細菌內(nèi)毒素含量。 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法測定肺組織勻漿炎癥因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)]的水平。光鏡和透射電鏡下觀察肺組織病理學變化。結(jié)果：模型組的血液細菌內(nèi)毒素含量(EU/mL)明顯高于對照組。與模型組相比，柴胡總多糖高劑量組可明顯降低肺組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平，減輕肺組織結(jié)構(gòu)損傷。結(jié)論：柴胡總多糖通過抑制炎癥反應(yīng)，減輕LPS誘導的ETM大鼠肺損傷。

內(nèi)毒素血癥(ETM)時可引起多種促炎細胞因子的過度表達，導致全身炎癥性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和(或)多器官功能障礙綜合征；其中急性肺損傷(ALI)是感染后出現(xiàn)最早及發(fā)生率最高的并發(fā)癥之一，臨床病死率高達30%～60%。[1]近年來，隨著對中醫(yī)學的重視及對內(nèi)毒素血癥的研究深入，中藥制劑顯示了很好的抗內(nèi)毒素作用。[2-3]柴胡總多糖具有抗輻射、降血脂、增強免疫功能和抗病毒等作用，對系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎炎、類風濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病具有重要的臨床價值。[4]已有研究證實柴胡總多糖可通過降低內(nèi)毒素誘導的肺泡灌洗液細胞脂質(zhì)過氧化程度，減少ALI中肺組織補體活化產(chǎn)物的沉積，從而減輕肺組織損傷；可通過抑制補體和單核巨噬系統(tǒng)的過度激活對大鼠急性肺損傷起到保護作用。[5-6]本研究旨在通過靜脈注射脂多糖(LPS)復制大鼠ETM模型，從整體水平觀察柴胡總多糖對LPS誘導的大鼠肺損傷的影響。

1 材料

1.1 動物 雄性健康清潔級Sprague Dawley (SD)大鼠40只，體質(zhì)量(180±20)g，河北省實驗動物中心提供，許可證號1707190。實驗前12 h禁食不禁水。

1.2 藥品與試劑 柴胡總多糖(西安匯林生物科技有限公司，含量30.34%，批號HL-160120)；地塞米松片(0.75 mg/片，天津藥業(yè)集團遂成藥業(yè)股份有限公司)；LPS(美國Sigma公司，E.coli LPS, serotype 0111:B4)；內(nèi)毒素顯色基質(zhì)鱟試劑定量檢測試劑盒(廈門鱟試劑有限公司)； 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(TNF-α、IL-1β、IL-6，澳大利亞Bender MedSystem公司)；其余試劑為分析純。

1.3 儀器 Versamax型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Molecular Devices)；高速電動勻漿器DY89-2(寧波新芝有限公司)；RM2135 Leica石蠟切片機(德國Leica公司)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)；尼康全自動顯微照相系統(tǒng)(日本尼康公司)；H-7500透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

2 方法

2.1 制備動物模型及分組 健康雄性清潔級，體質(zhì)量(180±20)g，SD大鼠共計40只，采取1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，遵照隨機數(shù)字表法，每組8只，共分為5組：對照組(生理鹽水)、模型組(LPS)、地塞米松組(陽性藥物組)、柴胡總多糖低劑量組(LPS+柴胡總多糖低劑量)、柴胡總多糖高劑量組(LPS+柴胡總多糖高劑量)。腹腔注射20%烏拉坦(0.5 mL/100 g)，尾靜脈注入LPS ( 4 mg/kg)復制ETM大鼠模型。在LPS入血1 h后，柴胡總多糖低、高劑量組(50 mg/kg、150 mg/kg)，地塞米松組(2 mg/kg)分別灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3 d。對照組等時間點給予等量生理鹽水。末次給藥6 h后留取肺臟進行指標檢測。

2.2 血液細菌內(nèi)毒素含量 尾靜脈注入LPS 1 h后，終點顯色基質(zhì)鱟試劑法檢測對照組和模型組大鼠血液，內(nèi)毒素含量>0.2 EU/mL標志成功建立ETM大鼠模型。

2.3 肺組織促炎細胞因子水平 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組大鼠右肺組織中下葉勻漿中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)的水平。

2.4 肺組織病理學變化 取左肺上葉，10%甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學變化。取1 mm3左肺下葉組織3～5塊，4%戊二醛固定，1%鋨酸后固定，常規(guī)電鏡標本制樣，透射電鏡觀察肺組織結(jié)構(gòu)變化。

3 結(jié)果

3.1 血液內(nèi)毒素含量 模型組大鼠血液細菌內(nèi)毒素含量顯著高于對照組(P<0.05)，詳見表1。

組別內(nèi)毒素/(EU·mL-1)對照組0.13±0.03 模型組1.98±0.15△

注：與對照組比較，△P<0.05。

3.2 柴胡總多糖對肺組織促炎細胞因子水平的影響 模型組大鼠肺組織TNF-α、IL-1β和IL-6水平顯著高于對照組(P<0.05)。與模型組相比，地塞米松組和柴胡總多糖高劑量組可明顯降低3種細胞因子水平(P<0.05)。詳見表2。

組別TNF-αIL-1βIL-6對照組 509.00±121.84 412.30±54.42 104.36±18.47 模型組1 350.87±284.37△3 488.94±401.08△1 315.64±174.85△地塞米松組 881.42±164.22?2 213.56±278.52? 769.37±127.60?柴胡總多糖低劑量組1 233.11±180.28△3 183.31±505.82△1 199.25±165.08△柴胡總多糖高劑量組 981.45±127.31? 2 624.05±328.33? 813.72±161.09?

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.3 光鏡下柴胡總多糖對ETM大鼠肺組織病理學改變 對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，無異常改變。模型組大鼠肺泡壁增寬加厚，毛細血管擴張淤血，伴炎性細胞浸潤，肺泡腔明顯萎縮塌陷。與模型組相比，地塞米松組和柴胡總多糖高劑量組可明顯改善上述病變。見圖1。

注：A 對照組；B 模型組；C 地塞米松組；D 柴胡總多糖低劑量組；E 柴胡總多糖高劑量組。

3.4 電鏡下柴胡總多糖對ETM大鼠肺組織病理學改變 對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)形態(tài)正常，無異常改變。模型組大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞微絨毛減少，板層小體減少，線粒體腫脹。與模型組相比，地塞米松組和柴胡總多糖高劑量組可明顯改善上述病變。見圖2。

注：A 對照組；B 模型組；C 地塞米松組；D 柴胡總多糖低劑量組；E 柴胡總多糖高劑量組。

圖2 電鏡下觀察柴胡總多糖對ETM大鼠肺組織病理學改變(×10 000)

4 討論

內(nèi)毒素，主要存在于革蘭氏陰性細菌細胞壁，其主要的活性成分是脂多糖(LPS)。近年來實驗室運用血漿內(nèi)毒素檢測，尤其是革蘭陰性菌感染，具有高度敏感性且檢測時間短的特點，鑒于此特點，血漿內(nèi)毒素檢測不僅能夠及時為臨床醫(yī)生提供早期的疾病診斷，還可為臨床醫(yī)生如何針對敏感菌而應(yīng)用正確合理的抗感染藥物治療進行有效的指導。[7]內(nèi)毒素檢測已成為臨床判斷ETM形成的標志。[8]臨床中目前內(nèi)毒素檢測的方法主要應(yīng)用鱟試驗動態(tài)濁度法或者游離顯色基質(zhì)法測定，且由于此2種檢測方法的前處理方式及測定原理的差異，因此ETM時判定內(nèi)毒素水平的參考值亦存在一定的差異，既往研究報道顯示正常大鼠血漿中內(nèi)毒素水平大約在0.1 EU/mL，而ETM大鼠血漿內(nèi)毒素水平>0.1 EU/mL。[9]綜合文獻及預實驗結(jié)果，擬定內(nèi)毒素水平>0.2 EU/mL為大鼠ETM。實驗結(jié)果顯示，模型組血液細菌內(nèi)毒素含量(1.98±0.15)EU/mL，提示成功建立ETM模型。

TNF-α和IL-1β是主要的快速反應(yīng)促炎介質(zhì)，ALI早期短時間內(nèi)即可出現(xiàn)，二者共同啟動并產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導致全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的發(fā)生，在炎癥過程中起著關(guān)鍵作用，并在一定程度上可反映病情的變化。同樣作為主要的促炎細胞因子之一的IL-6， 是在TNF-α、IL-1β誘導下而生成，當肌體發(fā)生炎癥反應(yīng)時，可作為重要的誘生劑而誘導肝臟合成多種急性期反應(yīng)蛋白，因此IL-6與肌體SIRS的發(fā)生呈正相關(guān)，也被作為是反映臨床危重病患者如膿毒癥、SIRS及多臟器功能衰竭等病情變化，及判斷危重病患者預后的一個重要參考指標。[10]此外異常表達的TNF-α 與肺組織TNF-α 受體結(jié)合，同時釋放大量酶類，直接損傷肺血管內(nèi)皮細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞，引起肺臟炎癥反應(yīng)。[11]

中醫(yī)學認為“熱由毒生，變由毒起”，中醫(yī)的熱毒和內(nèi)毒素在致病機制上也基本一致。可由熱毒內(nèi)盛、氣陰兩虛，使血中津液匱乏，而瘀血阻滯，因此祖國醫(yī)學防治ETM，是將清熱解毒、活血化瘀以及益氣養(yǎng)陰作為根本療法。[12]柴胡是傘形科多年生草本植物，以干燥根供藥用，其性微寒，其味微辛微苦，可輕清、升發(fā)、疏散，具和解退熱、疏肝解郁、升陽舉陷之功。因此目前臨床中常用其疏少陽之機，祛半表半里之邪，治療發(fā)熱惡寒、氣虛下陷等癥。[5]現(xiàn)代藥理學研究證實，柴胡總多糖除具有抗輻射、降血脂效用外，還具有增強免疫和抗病毒的功能，對臨床中常見的自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎炎、類風濕關(guān)節(jié)炎等具有重要的臨床價值。[4]

根據(jù)實驗結(jié)果，LPS誘導的模型組大鼠中，肺組織勻漿促炎細胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6水平顯著升高，柴胡總多糖高劑量組可明顯抑制LPS誘導的肺組織炎癥因子 TNF-α、IL-1β和IL-6的生成，且與地塞米松組無差異，提示柴胡總多糖可對內(nèi)毒素血癥大鼠肺組織損傷發(fā)揮抗炎作用。此外，LPS尾靜脈注射后，光鏡下模型組大鼠肺泡壁增寬加厚，毛細血管擴張淤血，伴炎性細胞浸潤，肺泡腔明顯萎縮塌陷。電鏡下模型組大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞微絨毛減少，板層小體減少，線粒體腫脹。上述結(jié)果組織病理學改變與文獻報道一致，再一次提示ETM大鼠肺損傷模型成功。應(yīng)用柴胡總多糖(高劑量)后，亦可明顯減輕上述肺組織病理學改變，提示柴胡總多糖可對內(nèi)毒素血癥大鼠的肺組織損傷有改善作用。

綜合上述實驗結(jié)果，柴胡總多糖可通過抑制內(nèi)毒素血癥大鼠急性肺損傷的炎癥反應(yīng)，減輕LPS誘導的肺組織損傷，對內(nèi)毒素血癥大鼠肺組織損傷具有一定的防治作用。