炙甘草湯對糖尿病性心肌病模型大鼠心功能的影響

胡鵬飛 陸 明 楊 明 黃抒偉

糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病患者的重要心血管并發(fā)癥，獨立于冠心病或高血壓性心臟病之外，臨床多表現(xiàn)為心功能不全[1]。其致病機制復雜，目前認為主要由于長期高血糖，心肌能量代謝異常，導致心肌細胞凋亡，膠原沉積，間質纖維化，從而造成心臟收縮及舒張功能下降[2-3]。近期研究表明，自噬也參與DCM 的病理生理機制，自噬是廣泛存在于真核細胞中的生命現(xiàn)象，對細胞維持本身代謝需求及內環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要意義[4-5]。DCM可歸屬中醫(yī)“心悸”“怔忡”“胸痹”“驚悸”“胸 痛”“真心痛”等范疇。炙甘草湯源自漢代張仲景《傷寒論》，臨床具有改善心功能之功效。本研究觀察炙甘草湯對DCM 模型大鼠心功能的影響，探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 動 物 清潔級雄性SD 大鼠40 只，120～140g，浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005，動物倫理批號：2017243。自由飲水，飼養(yǎng)環(huán)境（21±2）℃，濕度環(huán)境（55±5）%。動物合格證號：SCXK（浙）2014-0001。

1.2 藥 物 炙甘草湯制備：炙甘草12g，生姜、桂枝各9g，人參6g，生地50g，阿膠（后烊化）6g，麥冬、麻仁各10g，大棗10 枚，購自浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院中藥房，加水780mL（按每克生藥加水6mL），冷水浸泡30min，煮沸后再文火慢煎40min，趁熱過濾濾液，自然滴盡，二煎加水520mL（按每克生藥加水4mL），煮沸后，文火慢煎40min，趁熱過濾濾液，自然滴盡，合并濾液，內阿膠烊化，95℃水浴濃縮至130mL，濃度為1mg/mL。

1.3 試 劑 Bcl 相關X 蛋白（Bcl-associated X protein，Bax 批號5023S），B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2，批 號15071S），P62（SQSTM1/P62，批號16177S），自噬標記蛋白Beclin-1（Beclin-1，批號4122S），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde -3 -phosphate dehydrogenase，GAPDH，批 號5174S）抗體購自美國CST 公司；微管相關蛋白1 輕鏈3-Ⅰ/Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain3-Ⅰ/Ⅱ，LC3-Ⅰ/Ⅱ，批號ABC929）抗體購自美國Sigma 公司，鼠腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP，批號20180112）檢測試劑盒購自南京建成科技有限公司；鏈尿佐霉素（streptozotocin，STZ，批號20171221）購自北京索來寶生物技術有限公司。

1.4 儀 器 小動物超聲系統(tǒng)：Fuji film 公司vevo1100 系統(tǒng)；羅氏活力型血糖儀：ACCU-CHEK Active 型，德國羅氏診斷公司生產(chǎn)。

2 實驗方法

2.1 分組及造模 先將40 只SD 大鼠進行適應性喂養(yǎng)1 周，開放式供給基礎飼料和水。采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分成正常對照組、DCM 模型組、炙甘草湯低、高劑量組，每組10 只。正常對照組給予低脂飼料飲食，其余三組給予高脂飼料飲食，4 周后四組大鼠均行腹腔葡萄糖耐量（intra-peritoneal glucose tolerance test，IPGTT）及腹腔胰島素耐量試驗（intraperitoneal insulin tolerance test，IPITT）。DCM模型組及炙甘草湯低、高劑量組出現(xiàn)胰島素抵抗者給予一次性腹腔注射35mg/kg STZ 的檸檬酸緩沖液（pH4.5）誘導大鼠產(chǎn)生高血糖。正常對照組給予同等體積的檸檬酸緩沖液腹腔注射。1 周后，測定大鼠空腹血糖，連續(xù)2 次空腹血糖≥11.1mmol/L 為2 型糖尿病造模成功，納入后期實驗。至STZ 注射后8 周，心超提示左室舒張功能減退提示開始進展為DCM，表明DCM 造模成功。

2.2 給 藥 DCM 造模成功后，炙甘草湯低劑量組給予1mL/100g 炙甘草湯灌胃，炙甘草湯高劑量組給予2mL/100g 炙甘草湯灌胃，正常對照組及DCM 模型組給予等量雙蒸水灌胃，至STZ 注射后12 周，檢測大鼠心功能并處死大鼠獲取心肌組織標本。

2.3 指標檢測

2.3.1 ELISA 法測定血清BNP 水平 各組大鼠STZ注射前、后12 周取靜脈血2mL，37℃水浴15min，2500r/min 離心15min，取上清，-80℃冰箱保存，ELISA 法測定血清BNP 水平。

2.3.2 心臟超聲評價心功能 各組大鼠稱重后用10%水合氯醛（400mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉后仰臥固定，采用頻率為14MHz 的高頻心臟超聲探頭。取3個心動周期的平均值記錄數(shù)據(jù)。超聲學檢測指標：左心室收縮末期內徑（left ventricular end-systolic dimension，LVESD），左心室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD），升高左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，EF），左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，F(xiàn)S）。

2.3.3 Western blot 測定相應蛋白表達水平 取各組大鼠左心室心肌組織，加入液氮后進行研磨，加入含PMSF 的RIPA 裂解液冰上反復震蕩裂解30min，13000r/min 離心10min，取上清液，通過BCA 法定量。加入5×loading buffer 上樣緩沖液并煮沸5min。電泳時用5%濃縮膠，12%分離膠。電壓首先用50V，待指示條帶越過濃縮膠后將電壓調至120V，指示帶到達分離膠底部時終止電泳，后轉印至PVDF膜上進行轉膜，5%脫脂牛奶封閉2h，分別孵育相應抗體（凋亡相關蛋白Bcl-2，Bax；自噬相關蛋白P62，LC3-Ⅰ/Ⅱ，Beclin-1） 過夜。TBS-T 洗3 次，每次10min，室溫加入二抗孵育1h，ECL 法顯影，富士LAS-4000 曝光機上曝光顯像，每組標本5 個。

2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0 軟件作統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（） 表示，組間兩兩比較采用單因素方差分析（ANVOA），配對分析采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 炙甘草湯對DCM 模型大鼠血清BNP 的影響DCM 模型組大鼠12 周時血清BNP 水平高于正常對照組（P<0.05），說明DCM 模型造模成功。藥物治療12 周時，與DCM 模型組比較，炙甘草湯低、高劑量組大鼠血清BNP 水平均顯著降低（P<0.05），與炙甘草湯低劑量組比較，高劑量組下降更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠治療前后血清BNP 水平比較（pg/mL，）

表1 各組大鼠治療前后血清BNP 水平比較（pg/mL，）

注：正常對照組及DCM 模型組給予等量雙蒸水灌胃；炙甘草湯低劑量組給予1mL/100g 炙甘草湯灌胃；炙甘草湯高劑量組給予2mL/100g炙甘草湯灌胃；BNP 為腦鈉肽；DCM 為糖尿病性心肌?。慌c正常對照組比較，aP<0.05；與DCM 模型組比較，bP<0.05；與炙甘草湯低劑量組比較，cP＜0.05

3.2 大鼠心臟超聲評價炙甘草湯對DCM 模型大鼠心功能的影響 實驗第12 周，與正常對照組比較，DCM 模型組LVESD、LVEDD 增加（P<0.05），EF、FS水平下降（P<0.05）。與DCM 模型組比較，炙甘草湯低、高劑量組LVESD、LVEDD 下降（P<0.05），EF、FS水平升高（P<0.05），與炙甘草湯低劑量組比較，高劑量組大鼠上述心功能指標改善更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

3.3 炙甘草湯對DCM 模型大鼠心肌凋亡水平的影響 實驗第12 周，Western blot 檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax 表達，與正常對照組比較，DCM 模型組Bax 表達上調，Bcl-2 表達下調（P<0.05）；與DCM 模型組比較，炙甘草湯低、高劑量組Bax 表達下調，Bcl-2 表達上調（P<0.05）；與炙甘草湯低劑量組比較，高劑量組Bax、Bcl-2 表達改善更明顯（P＜0.05）。見圖1、表3。

表2 各組大鼠心臟超聲心功能指標比較（）

表2 各組大鼠心臟超聲心功能指標比較（）

注：正常對照組及DCM 模型組給予等量雙蒸水灌胃；炙甘草湯低劑量組給予1mL/100g 炙甘草湯灌胃；炙甘草湯高劑量組給予2mL/100g 炙甘草湯灌胃；EF 為射血分數(shù)；FS 為左室短軸縮短率；LVESD 為左心室收縮末期內徑；LVEDD 為左心室舒張末期內徑；DCM 為糖尿病性心肌??；與正常對照組比較，aP<0.05；與DCM 模型組比較，bP<0.05；與炙甘草湯低劑量組比較，cP＜0.05

圖1 Western blot 檢測各組大鼠心肌凋亡相關蛋白

表3 各組大鼠心肌凋亡相關蛋白表達量比較（）

表3 各組大鼠心肌凋亡相關蛋白表達量比較（）

注：正常對照組及DCM 模型組給予等量雙蒸水灌胃；炙甘草湯低劑量組給予1mL/100g 炙甘草湯灌胃；炙甘草湯高劑量組給予2mL/100g炙甘草湯灌胃；Bax 為Bcl 相關X 蛋白；Bcl-2 為B 淋巴細胞瘤-2；GAPDH 為內參；DCM 為糖尿病性心肌??；與正常對照組比較，aP<0.05；與DCM 模型組比較，bP<0.05；與炙甘草湯低劑量組比較，cP＜0.05

3.4 炙甘草湯對DCM 模型大鼠心肌自噬水平的影響 Western blot 檢測自噬相關蛋白P62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 表達，與正常對照組比較，DCM 模型組P62 表達上調，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 表達下調（P<0.05）；與DCM 模型組比較，炙甘草湯低、高劑量組P62 表達下調，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1 表達上調（P<0.05）；與炙甘草湯低劑量組比較，高劑量組上述指標改變更明顯（P＜0.05）。見圖2、表4。

4 討論

糖尿病長期糖、脂代謝紊亂是導致DCM 發(fā)病的重要原因之一[6]。糖尿病時心臟能量底物的改變使得心肌能量來源以脂肪酸β 氧化為主[7-8]。此外，脂代謝產(chǎn)生的脂毒性中間產(chǎn)物可使心肌細胞凋亡增多，引起一系列病理生理變化，使心肌重塑，心肌結構和功能的改變最終導致DCM 的發(fā)生發(fā)展[9]。目前，臨床上DCM 診斷尚無統(tǒng)一標準。

圖2 Western blot 檢測各組大鼠心肌自噬相關蛋白

表4 各組大鼠心肌自噬相關蛋白表達量比較（）

表4 各組大鼠心肌自噬相關蛋白表達量比較（）

注：正常對照組及DCM 模型組給予等量雙蒸水灌胃；炙甘草湯低劑量組給予1mL/100g 炙甘草湯灌胃；炙甘草湯高劑量組給予2mL/100g炙甘草湯灌胃；LC3 為微管相關蛋白1 輕鏈3；P62 為SQSTM1/P62 蛋白；Beclin-1 為自噬標記蛋白Beclin-1；GAPDH 為內參；與正常對照組比較，aP<0.05；與DCM 模型組比較，bP<0.05；與炙甘草湯低劑量組比較，cP＜0.05

自噬在營養(yǎng)供應、能量變化時對維持細胞內代謝平衡具有重要作用[10]。在體內能量代謝紊亂或者營養(yǎng)缺乏時自噬可作為一種內源性的產(chǎn)能方式，兩種主要啟動自噬的機制為AMP 激活的蛋白激酶（adenosine 5＇-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）AMPK[11]和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR） 信號通路mTORC[12]。然而，糖尿病狀態(tài)下能量缺乏時脂代謝異常產(chǎn)生的大量脂毒性中間產(chǎn)物可使心肌細胞凋亡增多[13]。因此，自噬與凋亡都參與了DCM 的發(fā)生發(fā)展。自噬在DCM 發(fā)病機制的各個重要環(huán)節(jié)中起重要調控作用，包括糖代謝異常、血清游離脂肪酸增高而導致心肌細胞脂毒性，以及氧化應激、胰島素抵抗導致心肌功能障礙和心臟結構的改變[14]。

炙甘草湯源自漢代張仲景《傷寒論》，方中炙甘草、人參、桂枝常用于DCM 等陰血陽氣虛弱證候的治療，臨床具有改善心功能之功效。本研究發(fā)現(xiàn)，炙甘草湯能降低DCM 模型大鼠血清BNP 水平，升高EF，改善DCM 模型大鼠心功能，同時發(fā)現(xiàn)DCM 模型組大鼠凋亡蛋白Bcl-2 表達下調，促凋亡蛋白Bax表達上調，自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，Beclin-1表達下調，P62 表達上調，即DCM 大鼠心肌細胞凋亡增多，自噬減弱，而炙甘草湯藥物干預可逆轉這一現(xiàn)象，高劑量組效果更明顯。本研究推測炙甘草湯可能通過增強心肌細胞自噬，自噬作為保護性機制增加心肌細胞清除受損細胞器能力，改善心肌細胞能量代謝，從而抑制心肌細胞凋亡，改善DCM 模型大鼠心功能，但其具體機制及相關信號通路尚不明確，有待細胞實驗及進一步動物實驗驗證。

綜上所述，炙甘草湯對DCM 模型大鼠心功能具有保護作用，其機制可能通過增強心肌細胞自噬，自噬作為保護性機制抑制心肌細胞凋亡相關。