藻際可培養(yǎng)細(xì)菌對雨生紅球藻生長和蝦青素積累的影響?

李 蕓，劉發(fā)龍，王巧晗,2??，劉 巖,2，李景玉,2，宮慶禮,2

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003)

自然環(huán)境中，微藻與細(xì)菌之間的相互作用非常復(fù)雜。以微藻為研究對象的正面作用中，藻際某些細(xì)菌可以通過提供營養(yǎng)[1]、維生素[2]、植物激素[3]、螯合劑[4]、或揮發(fā)性有機(jī)化合物[5]，創(chuàng)造有利的生長環(huán)境[6]等方式來促進(jìn)微藻生長；反面作用：細(xì)菌通過與微藻競爭營養(yǎng)物質(zhì)[6]，產(chǎn)生毒素[7]，產(chǎn)生抑制微藻生長的物質(zhì)[8]等方式抑制藻體生長。此外，一些細(xì)菌雖然在培養(yǎng)前期可以促進(jìn)微藻生長，但到培養(yǎng)后期最終會通過多種方式殺死它們的微藻宿主[9-11]。因此，細(xì)菌群落對提升或降低微藻的生產(chǎn)力有潛在作用。所以確定哪些細(xì)菌具有正面或負(fù)面影響，以及其在藻際細(xì)菌群落中是否占據(jù)優(yōu)勢地位是非常重要的。假設(shè)可以將培養(yǎng)體系中細(xì)菌對微藻生長的積極影響擴(kuò)大，消除細(xì)菌對微藻的消極影響，并且結(jié)合物理化學(xué)方法優(yōu)化微藻生物量生產(chǎn)，可能會大大提高微藻生產(chǎn)力，具有較強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)意義。

目前已有研究顯示巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)可以促進(jìn)小球藻(Chlorellavulgaris)的生長[12]；根瘤菌屬(Rhizobiumsp.)能促進(jìn)萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、小球藻和布氏藻(Brucellabraunii)的生長[13]等。目前關(guān)于雨生紅球藻藻際細(xì)菌的研究甚少，藻際細(xì)菌的研究大多集中在大型藻類(比如海帶及紫菜)、赤潮藻類[14-18]，以及一小部分餌料微藻[19-20]，所以關(guān)于雨生紅球藻藻際細(xì)菌多樣性及菌群結(jié)構(gòu)可查閱的文獻(xiàn)及研究進(jìn)展也非常有限；另外，混合營養(yǎng)條件下的研究更是少之又少。其中張懷瑾[21]從自養(yǎng)培養(yǎng)的雨生紅球藻藻際分離得到一株橘紅色的戈登氏菌株(Gordoniaterrae)，研究發(fā)現(xiàn)該菌株能夠合成胡蘿卜素，其提取物也有較強(qiáng)的抗氧化性，且耐高溫，推測其可能參與雨生紅球藻的蝦青素合成途徑，具有巨大的研究價值。探究雨生紅球藻藻際細(xì)菌多樣性，獲得對雨生紅球藻生長的有益微生物，并且利用有益微生物來促進(jìn)雨生紅球藻綠色階段細(xì)胞數(shù)量的增加或者提高雨生紅球藻紅色階段的蝦青素積累量，對雨生紅球藻養(yǎng)殖具有巨大的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)意義。本實驗采用培養(yǎng)分離法，利用細(xì)菌LB培養(yǎng)基分離了乙酸鈉兼養(yǎng)條件下雨生紅球藻藻際細(xì)菌，探究了雨生紅球藻藻際可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性，并利用16S rDNA測序方法對分離細(xì)菌鑒定；將篩選到的細(xì)菌液體培養(yǎng)，分別將細(xì)菌菌液按照一定的濃度與處于活躍期的藻種共培養(yǎng)，確定單一細(xì)菌對雨生紅球藻生長及蝦青素積累的影響。試圖利用藻際細(xì)菌來提高雨生紅球藻生物量生產(chǎn)或提高蝦青素含量。

1 實驗材料

1.1 藻種及培養(yǎng)條件

本實驗所使用的藻種為雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)，為中國海洋大學(xué)藻類學(xué)與藻類養(yǎng)殖研究實驗室保存藻種。其長期在本實驗室光照培養(yǎng)箱中于錐形瓶培養(yǎng)；培養(yǎng)條件如下：

①綠色階段：培養(yǎng)溫度：23 ℃；光照強(qiáng)度:60 μmol·m-2·s-1；光暗周期：14 h∶10 h；光源：日光燈。

②紅色階段：培養(yǎng)溫度：26 ℃；光照強(qiáng)度:120 μmol·m-2·s-1；光暗周期：24 h∶0 h；光源：日光燈。實驗所用雨生紅球藻培養(yǎng)基為MCM培養(yǎng)基[22]；pH調(diào)節(jié)為6.99～7.03。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

分離純化雨生紅球藻藻際細(xì)菌使用淡水LB培養(yǎng)基培養(yǎng)[23]；固、液態(tài)培養(yǎng)基分置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

1.3 試劑藥品

抗生素類：氯霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素均購于北京索萊寶科技有限公司；有機(jī)溶劑及培養(yǎng)基藥品：甲醇、乙酸、二甲基亞砜、氫氧化鈉以及配制MCM培養(yǎng)液所需的試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；配制細(xì)菌通用培養(yǎng)基的試劑均購于Sigma-Aldrich公司。

2 實驗方法

2.1 雨生紅球藻藻際細(xì)菌的分離純化

將長期在乙酸鈉混合營養(yǎng)條件下培養(yǎng)且處于對數(shù)生長期的藻種，按照1∶10 的比例接種于含有270 mL滅菌MCM培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶中，設(shè)置3個重復(fù)。根據(jù)藻液實際濃度稀釋一定的倍數(shù)，分別吸取100 μL均勻涂布在提前倒好的無菌LB固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱，待長出菌落，及時挑取單菌落于新的LB固態(tài)培養(yǎng)基上，多次純化直至分離到純種菌落，且達(dá)到鑒定質(zhì)量。

2.2 細(xì)菌鑒定

2.2.1 試劑盒法提取細(xì)菌DNA 將純化好的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基，28 ℃，180 r/min 恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，8 000 r/min 離心5 min收集菌體。采用Bacterial DNA Kit試劑盒法提取各細(xì)菌DNA。

2.2.2 PCR擴(kuò)增 以提取的細(xì)菌DNA為模板，采用細(xì)菌16SrDNA序列通用引物27F(5′AGAGTTGATCCTGGCTCAG3)和1492R(5′TACGGTTACCTTGTTACGACTT3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳及菌株測序 PCR擴(kuò)增結(jié)束后，利用瓊脂糖凝膠電泳，來檢測擴(kuò)增結(jié)果。成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物隨后交由北京華大基因有限公司進(jìn)行測序。將公司測序返回的16S rDNA序列在NCBI上進(jìn)行BLAST搜索。將鑒定出的細(xì)菌序列上傳至NCBI網(wǎng)站，并獲得登陸號。

2.3 純種雨生紅球藻的獲得

本實驗中我們利用各抗菌譜抗生素聯(lián)合處理雨生紅球藻藻液，結(jié)合固態(tài)培養(yǎng)基純化獲得純種雨生紅球藻。通過查找常用抗生素抗菌譜，選擇的抗生素種類為：鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、氨芐青霉素。用超純水配制好10 g/L的抗生素母液，并采用抽濾方式除菌。4種抗生素同時分別添加(100～1 000 μg/mL；每100 μg/mL為一個梯度)處理雨生紅球藻藻液(共10個處理組，每個濃度設(shè)置3個重復(fù))。將擴(kuò)種的純種雨生紅球藻培養(yǎng)數(shù)代以消除抗生素影響后，以培養(yǎng)6 d、狀態(tài)較好的雨生紅球藻為藻種，收集離心并用滅菌培養(yǎng)液洗滌3次，重新懸浮在培養(yǎng)液中作為藻菌共培養(yǎng)的藻種。

2.4 細(xì)菌保種

接種純化好的單一菌株菌落，于裝有滅菌LB液體培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，搖床培養(yǎng)24 h后(T：28 ℃；轉(zhuǎn)速：180 r/min)；采用甘油與細(xì)菌菌液1∶1的比例保種于1.5 mL保種管中，并置于-80 ℃保存。

2.5 藻菌共培養(yǎng)菌種處理

分別取100 μL保種的菌液于裝有滅菌的LB液體培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中搖床培養(yǎng)24 h，用滅菌的50 mL離心管收集菌液并離心，去掉濾液，并用滅菌MCM培養(yǎng)液洗滌3次，重新用新鮮MCM培養(yǎng)液懸浮備用。

2.6 藻菌共培養(yǎng)

于含265 mL滅菌培養(yǎng)液的500 mL錐形瓶中，分別加入30 mL重新懸浮的藻種，然后分別加入5 mL重新懸浮OD600值為0.50左右(接種濃度為104cfu/mL)的菌液。對照組不加懸浮菌液以5 mL滅菌MCM培養(yǎng)液代替，各處理均設(shè)置3個重復(fù)。接種完成后，同時置于綠色階段培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。將培養(yǎng)至第10天的雨生紅球藻轉(zhuǎn)移至紅色階段條件下培養(yǎng)，每天取樣在光學(xué)顯微鏡下觀察藻細(xì)胞變紅情況。每天定點搖瓶3次，隨機(jī)交換錐形瓶位置，以避免藻細(xì)胞貼壁、沉降以及由于光照不均造成的誤差。

2.6.1 藻細(xì)胞密度的測定 在接種后第1天，每天取4 mL藻液于5 mL離心管中(取樣前要充分搖勻藻液，以免取樣不均所造成的誤差)，用滅菌的MCM培養(yǎng)液將藻液稀釋合適的倍數(shù)，取100 μL稀釋后的藻液于0.1 mL的浮游植物計數(shù)框中，在放大×100倍的光學(xué)顯微鏡下對藻細(xì)胞計數(shù)，每個樣品計數(shù)3次，以減少計數(shù)過程中出現(xiàn)的誤差。

2.6.2 藻液pH測定 在接種后第1天，每天取4 mL藻液于5 mL離心管中(取樣前要充分搖勻藻液，以免取樣不均所造成的誤差)。利用Accumet.Fisher Scientific pH計測定藻液pH值。

2.6.3 葉綠素含量測定 每隔一天分別取4 mL藻液于10 mL離心管中離心，去除上清液。采用甲醇比色法測定[24]藻液葉綠素含量變化。

2.6.4 蝦青素含量測定 待鏡檢雨生紅球藻細(xì)胞完全變紅后，分別取4.5 mL藻液于10 mL離心管中離心去上清液，綠色階段培養(yǎng)結(jié)束后，每天取樣顯微鏡下觀察藻細(xì)胞變紅情況。待對照組藻細(xì)胞完全變紅后，采用分光光度法測定藻液蝦青素含量[24]。

2.7 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)表示為每個處理37個重復(fù)測量的代表性數(shù)值。通過計算標(biāo)準(zhǔn)偏差來檢查結(jié)果的可靠性。使用軟件IBM SPSS Statistics 22 單因素方差分析。通過方差分析(ANOVA)方法評估平均值的差異，確定數(shù)據(jù)是否符合方差齊性以及正態(tài)分布，結(jié)果差異顯著性進(jìn)行Duncan檢驗，使用excel軟件作圖。

3 結(jié)果

3.1 藻際細(xì)菌的分離與鑒定

在乙酸鈉兼養(yǎng)雨生紅球藻藻際中共分離到8株細(xì)菌，分別編號為DBQ、HS、BTH、DBB、XBL、HB、FH、JH。分離到的細(xì)菌表觀特征如表1所示，照片如圖1所示。根據(jù)北京華大基因公司的測序結(jié)果，分別將8株細(xì)菌16S rDNA序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對，編號為DBQ、HS、BTH、DBB、XBL、HB、FH、JH的菌株分別于Pseudomonassp.,Methylobacteriumsp.、Chryseobacteriumsp.、Bacillussp.、Paracoccsusp.、Planctopirushydrillae、Rhodobactervinaykumarii、Brevundimonasvesicularis的16S rDNA序列具有最高的相似性。將8株細(xì)菌16S rDNA序列與其相近的細(xì)菌的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。將8株細(xì)菌16S rDNA的序列上傳至NCBI網(wǎng)站，獲得登陸號分別為MK675106、MK675107、MK675109、MK675110、MK675111、MK660006、MK660007、MK660008。

表1 藻際細(xì)菌表觀特征Table 1 The apparent characteristics of bacteria in the phycospherea

圖1 藻際細(xì)菌照片F(xiàn)ig.1 The picture of the bacterial in the phycospherea

3.2 抗生素處理雨生紅球藻

將不同濃度梯度的4種抗生素組合溶液與處于對數(shù)期兼養(yǎng)培養(yǎng)的雨生紅球藻一同接種于滅菌MCM培養(yǎng)液中處理培養(yǎng)3～5 d。每天搖瓶多次，以使抗生素與藻細(xì)胞充分接觸。處理結(jié)束，將用抗生素處理過的藻液接種于無菌的MCM培養(yǎng)液中培養(yǎng)5～7 d，并利用添加乙酸鈉的MCM固態(tài)培養(yǎng)基來檢測除菌效果。最終在鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、氨芐青霉素分別為600 μg/mL的聯(lián)合抗生素組合處理條件下，獲得純種雨生紅球藻藻落。并將純種藻種逐級擴(kuò)種培養(yǎng)。

3.3 單一細(xì)菌的添加對雨生紅球藻細(xì)胞密度的影響

如圖3所示。接種當(dāng)天即第0天的細(xì)胞密度不予測定，以避免藻細(xì)胞減少產(chǎn)生的不利影響。因XBL實驗組在培養(yǎng)過程中很早就出現(xiàn)細(xì)胞沉降，而且藻細(xì)胞聚集在一起被細(xì)菌菌膜包裹，計數(shù)時存在太大誤差，因此只統(tǒng)計了剩余7個處理組以及對照組的細(xì)胞密度變化情況。

由圖可以看出在綠色階段培養(yǎng)過程中，盡管藻細(xì)胞計數(shù)存在波動，但隨培養(yǎng)時間延長而不斷上升。第1～5 d，藻細(xì)胞密度增加幅度較大；培養(yǎng)后期增長較為緩慢；第9天大部分實驗組的藻細(xì)胞密度達(dá)到最大，第10天有稍微下降的趨勢，原因可能是隨著培養(yǎng)時間的增加，藻細(xì)胞貼壁的現(xiàn)象嚴(yán)重以及藻細(xì)胞出現(xiàn)沉降，導(dǎo)致細(xì)胞計數(shù)時存在誤差。細(xì)胞密度由最初接種密度約為2.50×104cells/mL，在HS處理組的第9天獲得最高細(xì)胞密度，為3.65×105cells/mL。培養(yǎng)第1～7天，除DBQ、HB及FHS處理組外，其他各處理組均對藻細(xì)胞密度的增加表現(xiàn)出促進(jìn)作用；但在培養(yǎng)結(jié)束時僅有HS、DBB 2個處理組中的藻細(xì)胞密度大于對照組(C)，且僅有HS處理組第9天細(xì)胞密度顯著高于對照組，其他處理組促進(jìn)效果并不顯著。DBQ處理組在10 d的培養(yǎng)過程中，密度顯著低于對照組以及其他處理組；其他處理組中藻細(xì)胞密度低于對照組，但與對照組差異并不顯著。在細(xì)胞計數(shù)時觀察到，處理組中藻細(xì)胞比較容易聚集在一起，不同于對照組大部分藻細(xì)胞都分散存在，也是處理組在計數(shù)時存在較大誤差的原因。

3.4 單一細(xì)菌對雨生紅球藻藻液pH的影響

圖4是各實驗組在培養(yǎng)過程中藻液pH變化情況。實驗開始時，培養(yǎng)體系pH為6.97～7.03。經(jīng)過10 d的培養(yǎng)，對照組pH最高達(dá)到9.36左右，其他處理組也都達(dá)到9.00左右的高pH。培養(yǎng)前期pH上升幅度較大，該時間段也對應(yīng)了藻細(xì)胞生長的對數(shù)期，所以通過pH的變化情況也可以從側(cè)面反映雨生紅球藻的生長分裂能力。第7～10天，pH變化幅度較小，甚至有下降的趨勢，其也對應(yīng)了實驗組中細(xì)胞密度增加緩慢的現(xiàn)象，說明雨生紅球藻已進(jìn)入穩(wěn)定生長期。而且各實驗組的pH除在第3～5天有顯著差異外，其余時間pH差異不顯著，特別是在培養(yǎng)結(jié)束時。因總培養(yǎng)體積有限所導(dǎo)致的取樣體積有限是導(dǎo)致pH測定過程中誤差較大的原因，另外實驗操作中也存在一定誤差。

3.5 單一細(xì)菌對雨生紅球藻葉綠素含量的影響

圖5是各實驗組在培養(yǎng)過程中藻液葉綠素含量變化情況。因培養(yǎng)初期藻細(xì)胞密度較低，所以從接種后的第3天開始每隔1 d取樣測定，到培養(yǎng)后期每天取樣測定葉綠素含量。由圖可以看出在培養(yǎng)期間的藻液葉綠素含量變化與藻細(xì)胞密度有一定的相似性。第3天，各實驗組的葉綠素含量無顯著差異。第6～8天，除HB、DBQ、XBL處理組外其余各處理組中的葉綠素含量均大于對照組，但與對照組并無顯著差異。第3～8天，各實驗組葉綠素含量都呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，在這段時期，細(xì)胞密度增加是導(dǎo)致葉綠素含量上升的主要因素；第8～10天，除對照組、DBQ處理組外，其他實驗組都呈現(xiàn)不變及下降的趨勢。另外，第9～10天，添加菌液的處理組葉綠素含量降低幅度普遍高于對照組。在藻液葉綠素測定過程中，因培養(yǎng)總體積不大，導(dǎo)致每天進(jìn)行葉綠素測定時取樣體積較小，及添加菌液的處理組在培養(yǎng)中后期藻細(xì)胞聚集在一起，導(dǎo)致取樣不均勻都是導(dǎo)致藻液葉綠素含量測定時出現(xiàn)較大誤差的原因。

圖2 8株藻際細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of 8 strains of bacteria in the phycosphere

(圖中不同字母間表示差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference between each other (P<0.05).)
圖3 藻菌共培養(yǎng)雨生紅球藻細(xì)胞密度
Fig.3 The cell density ofHaematococcuspluvialisin co-culture of algae and bacteria

(圖中不同字母間表示差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference between each other (P<0.05).)
圖4 藻菌共培養(yǎng)雨生紅球藻藻液pH
Fig.4 The pH value ofHaematococcuspluvialisin co-culture of algae and bacteria

(圖中不同字母間表示差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference between each other (P<0.05).)
圖5 藻菌共培養(yǎng)雨生紅球藻藻液葉綠素含量
Fig.5 The chlorophyll content ofHaematococcuspluvialisin co-culture of algae and bacteria

3.6 單一細(xì)菌對雨生紅球藻蝦青素積累的影響

圖6是單一細(xì)菌對雨生紅球藻藻液及單個藻細(xì)胞蝦青素含量的影響。雨生紅球藻經(jīng)過綠色階段的培養(yǎng)，藻細(xì)胞增加到一定數(shù)目，通過改變培養(yǎng)條件，以加快藻細(xì)胞中蝦青素的積累速率。實驗發(fā)現(xiàn)，對藻細(xì)胞密度增加有一定促進(jìn)作用的處理組中，僅有HS處理組略高于對照組，但差異并不顯著，蝦青素含量分別為44.35和43.84 mg/L。其他處理組藻液蝦青素含量或顯著低于對照組或與對照組無顯著差異。DBQ處理組雖細(xì)胞密度顯著低于對照組，但該處理組藻液蝦青素含量與對照組并無顯著差異。通過計算單個藻細(xì)胞蝦青素含量，發(fā)現(xiàn)DBQ處理組單個藻細(xì)胞蝦青素含量顯著高于對照組及其他處理組，因此DBQ菌液的添加的雖然不會促進(jìn)藻細(xì)胞密度的增加，但是對于單個藻細(xì)胞蝦青素積累來說有一定的優(yōu)勢。其他處理組單個細(xì)胞蝦青素含量顯著低于對照組或與對照組無顯著差異。

4 討論

現(xiàn)階段由于培養(yǎng)條件的限制，大多數(shù)異養(yǎng)細(xì)菌不能人為培養(yǎng)。有研究表明，我們僅能培養(yǎng)自然環(huán)境中占比不到1%的微生物[25-26]。但在本實驗中利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法獲得了8株藻際細(xì)菌，不僅探究了乙酸鈉兼養(yǎng)下雨生紅球藻藻際可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性，也為探究其對雨生紅球藻生長和蝦青素積累的影響提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。從藻際細(xì)菌種類來看，乙酸鈉兼養(yǎng)條件下的藻際可培養(yǎng)細(xì)菌種類豐富，相比張懷瑾在自養(yǎng)培養(yǎng)的雨生紅球藻藻際分離到1株藻際細(xì)菌的結(jié)果[21]，本實驗中乙酸鈉的添加是分離到藻際細(xì)菌種類較多的最大原因。乙酸鈉的添加不僅為藻細(xì)胞提供了異養(yǎng)營養(yǎng)的碳源，同時也為藻際細(xì)菌的生長繁殖提供了營養(yǎng)。分離到的藻際細(xì)菌以變形菌門(Proteobacteria)為主，該菌門也在很多海洋微藻藻際被分離到[17,27-29]，雖然雨生紅球藻為淡水微藻，其與海水細(xì)菌種類同源性還是較大的。另外，分離過程中擬桿菌門(Bacteroidetes)的Chryseobacteriumsp.是優(yōu)勢菌株，該菌株也是在自然環(huán)境中分離比較頻繁的細(xì)菌種類[30-31]。另外，有許多研究表明Paracoccussp.、Pseudomonassp.中的某些菌株具有降解有機(jī)污染物的能力[32-34]。

目前來說，獲得純種微藻的方法有很多。利用單一的除菌方法往往效果不佳，局限性較大，導(dǎo)致純化效率不高。本實驗中我們結(jié)合韓吉昌等[35]提供的無菌微藻獲得方法，采用應(yīng)用廣泛的抗生素處理法結(jié)合平板劃線法來獲得純種藻株。在藻菌共培養(yǎng)實驗中，發(fā)現(xiàn)有2株菌株(DBB、HS)對藻細(xì)胞密度增加有促進(jìn)作用，其分別屬于厚壁菌門(Bacteroidetes)、變形菌門。對于有些細(xì)菌在培養(yǎng)前期促進(jìn)藻細(xì)胞密度增加，而在培養(yǎng)后期抑制藻細(xì)胞生長的現(xiàn)象，很可能是因為培養(yǎng)前期各營養(yǎng)元素較為充足，并且異養(yǎng)細(xì)菌與藻細(xì)胞的營養(yǎng)方式有一定的互補(bǔ)作用，因此會加快藻細(xì)胞密度增加；而到培養(yǎng)中后期，由于各營養(yǎng)元素消耗殆盡，細(xì)菌很可能會與藻細(xì)胞爭奪微量元素或者其他物質(zhì)，因此會出現(xiàn)抑制作用；另一方面，因為分離的細(xì)菌菌株大部分會積累色素，隨著體系中細(xì)菌密度的增加，很可能對藻細(xì)胞產(chǎn)生遮光作用，會影響藻細(xì)胞對光能的利用效率；最后體系中細(xì)菌的大量繁殖，會產(chǎn)生菌膜，對藻細(xì)胞的自由運(yùn)動以及分裂產(chǎn)生阻礙作用，會加速藻細(xì)胞老化。另外，培養(yǎng)后期較高的pH值也許是限制雨生紅球藻細(xì)胞密度增加的另一個因素。

(圖中不同字母間表示差異顯著(P<0.05)。Data with different letters at the same column mean significant difference between each other (P<0.05).)
圖6 藻菌共培養(yǎng)雨生紅球藻藻液及單個細(xì)胞年蝦青素含量
Fig.6 The astaxanthin content ofHaematococcuspluvialisliquid and single cell in co-culture of algae and bacteria

綠色階段10天培養(yǎng)過程中pH上升幅度較大，一方面說明雨生紅球藻對培養(yǎng)體系中pH的緩沖作用較差，同時說明藻細(xì)胞對堿性培養(yǎng)環(huán)境的耐受度較高。王璇等人的研究中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)過程中藻液pH的變化與營養(yǎng)鹽濃度的變化存在一定的相關(guān)性[36]，另外在該研究中在綠色階段第 7 天后，pH 的升高放緩的現(xiàn)象[36]與本研究結(jié)果較為相似。各實驗組pH在接種后1～5 d顯著增加，這可以通過硝酸鹽代謝來解釋[37]：雨生紅球藻細(xì)胞的不斷生長繁殖使得MCM培養(yǎng)液中的硝酸鹽被轉(zhuǎn)移到雨生紅球藻細(xì)胞中，其中硝酸鹽通過硝酸還原酶和亞硝酸還原酶催化的兩個還原反應(yīng)被還原成銨；同時，在這些還原反應(yīng)中會產(chǎn)生OH-和H2O，由硝酸鹽轉(zhuǎn)化為銨產(chǎn)生的OH-將釋放到培養(yǎng)基中，是導(dǎo)致pH升高的重要原因。也有研究顯示外源碳乙酸鈉的添加也是導(dǎo)致藻液pH較高的原因，但Pang等[38]的實驗中，添加1.33 g/L乙酸鈉培養(yǎng)的雨生紅球藻藻液在培養(yǎng)結(jié)束后穩(wěn)定在8.50左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本實驗結(jié)束時9.30的pH。猜測，藻株及其他培養(yǎng)條件存在差異是出現(xiàn)巨大差異的原因。綠色階段后期藻液中CO2溶解度增加是藻液pH有下降趨勢的原因，因培養(yǎng)后期，藻液中營養(yǎng)元素已經(jīng)消耗殆盡，藻細(xì)胞光合作用強(qiáng)度下降，導(dǎo)致藻液中CO2濃度升高，其次菌液的添加使得處理組細(xì)菌可能會大量繁殖，也會產(chǎn)生一部分CO2使得藻液CO2溶解度增加。

處于綠色階段的雨生紅球藻細(xì)胞中主要色素組成為葉綠素、β-胡蘿卜素、葉黃素；紅色階段雨生紅球藻細(xì)胞中蝦青素含量會大幅度上升，還會出現(xiàn)角黃素以及海膽酮等次生胡蘿卜素[39-42]。藻液葉綠素含量的變化趨勢大體符合細(xì)胞密度變化趨勢，說明藻液葉綠素濃度在一定程度上可以反映藻細(xì)胞密度及細(xì)胞活力。本實驗中培養(yǎng)第8天后，各實驗組中葉綠素濃度的停滯及下降預(yù)示著藻細(xì)胞生長受到脅迫，比如培養(yǎng)體系中pH過高、營養(yǎng)元素消耗殆盡等，使得藻細(xì)胞內(nèi)的葉綠素向其他色素轉(zhuǎn)變，蝦青素開始積累。對于有些處理組中葉綠素含量降低幅度高于對照組的現(xiàn)象，一定程度上說明藻際細(xì)菌的添加會加快藻細(xì)胞由綠色階段向紅色階段的轉(zhuǎn)變速率，即藻際細(xì)菌的添加可能會抑制藻細(xì)胞的活力。如林偉等[43]發(fā)現(xiàn)，除菌后的球等鞭金藻及小球藻不易老化，更容易保持懸浮狀態(tài)；回加細(xì)菌于除菌藻，藻細(xì)胞容易下沉附底。

大量研究顯示雨生紅球藻在脅迫條件下，例如高溫、高光照、營養(yǎng)鹽缺乏等條件，細(xì)胞內(nèi)會大量積累蝦青素[44]。對藻細(xì)胞密度增加有一定促進(jìn)作用的 HS、DBB處理組，并不能顯著提高藻液蝦青素含量。對藻細(xì)胞密度增加有顯著抑制作用的DBQ處理組反而能顯著提高單個藻細(xì)胞蝦青素含量，DBQ處理組中單位藻細(xì)胞蝦青素含量較高的原因是復(fù)雜的，尤其細(xì)菌的存在會使得培養(yǎng)液的組分及其物質(zhì)循環(huán)變得更加復(fù)雜[45]。本實驗中DBQ處理組顯著抑制雨生紅球藻生長所造成的脅迫環(huán)境對藻細(xì)胞蝦青素積累是有利的，推測原因可能是DBQ的添加促進(jìn)了藻細(xì)胞內(nèi)的蝦青素合成途徑[46]，比如DBQ有可能會產(chǎn)生合成蝦青素的前體物質(zhì)[46]，或者促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)中酶活性加快蝦青素積累[48]，導(dǎo)致單位細(xì)胞內(nèi)蝦青素含量較高。本實驗結(jié)果也充分說明想要提高雨生紅球藻蝦青素產(chǎn)量，綠色階段生物量的積累和紅色階段單位藻細(xì)胞的蝦青素積累效率都是必要的。因此可以考慮在雨生紅球藻綠色階段結(jié)束后，添加DBQ菌株的菌液，以達(dá)到促進(jìn)單個藻細(xì)胞中蝦青素積累的效果。

5 結(jié)語

本實驗在乙酸鈉混合營養(yǎng)條件下，分離了8株雨生紅球藻藻際細(xì)菌。經(jīng)過16S rDNA鑒定發(fā)現(xiàn)其分別屬于Pseudomonassp.、Methylobacteriumsp.、Chryseobacteriumsp.、Bacillussp.、Paracoccussp.、Planctopirushydrillae、Rhodobactervinaykumarii、Brevundimonasvesicularis。在單一細(xì)菌與雨生紅球藻共培養(yǎng)實驗在，發(fā)現(xiàn)Methylobacteriumsp.、Bacillussp.能夠促進(jìn)綠色階段雨生紅球藻藻細(xì)胞密度的增加，Pseudomonassp.對于增加單位細(xì)胞蝦青素含量具有一定優(yōu)勢。