AM 真菌對桑樹根圍土壤團聚體的影響機制*

肖玖軍，邢 丹，毛明明，王 巖

（1. 貴州省山地資源研究所，貴陽550001；2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所，貴陽 550006；3. 貴州大學農(nóng)學院，貴陽 550025）

以貴州為中心的西南地區(qū)是我國巖溶分布的典型區(qū)域，由于長期土地利用不合理、土壤瘠薄、水土流失嚴重、抗侵蝕能力較差，現(xiàn)已成為制約該區(qū)域可持續(xù)發(fā)展的重要生態(tài)環(huán)境問題[1]。因此，選擇水土保持能力強并兼具喜鈣、石生、旱生等特點的植物進行恢復重建，是實現(xiàn)該地區(qū)生態(tài)環(huán)境治理的關鍵[2]。土壤團聚體作為土壤結(jié)構(gòu)的基本單元，對土壤水分滲透與保持、表層土壤侵蝕及植物生長影響較大，其穩(wěn)定性是評價土壤抗蝕性的主要指標之一[3]。通常利用大團聚體（粒徑＞ 0.25 mm）百分含量、團聚體平均質(zhì)量直徑（Mean weight diameter，MWD）、幾何平均直徑（Geometric mean diameter，GMD）和團聚體破壞率（Percentage of aggregate destruction，PAD）反映土壤團聚體穩(wěn)定性[4]。在退化生態(tài)系統(tǒng)植被恢復過程中，叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizal，AM）真菌能與大部分植物形成共生關系，可促進植物生長及土壤團聚體的形成和穩(wěn)定，從而提高巖溶等退化生態(tài)系統(tǒng)植被重建的成功率、保證修復效果的持續(xù)性和穩(wěn)定性[5]。其中，AM 真菌的菌絲隨宿主植物根系生長分泌產(chǎn)生一類具有“超級膠水”性能的特異性蛋白，即球囊霉素相關土壤蛋白（Glomalin-related soil protein，GRSP），是土壤團聚體形成的重要黏合劑，能夠提高土壤水分的滲透力和土壤穩(wěn)定性、多孔結(jié)構(gòu)[6]。接種 AM 真菌能夠提高 GRSP 含量，進而促進土壤大團聚體形成并增強土壤結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[7]，因而 GRSP 作為有機膠結(jié)物質(zhì)對土壤團聚體的形成和穩(wěn)定具有重要的促進作用[8]。桑樹（Morus alba）易與AM 真菌形成共生關系[9]，但巖溶生態(tài)系統(tǒng)利用接種 AM 真菌的桑樹進行植被恢復過程中，桑樹根圍土壤GRSP 對土壤團聚體改善及土壤結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性是否有明顯的促進作用尚需探索。

土壤團聚體的形成與穩(wěn)定對土壤有機碳（Soil organic carbon，SOC）具有重要的物理保護作用，而SOC 是各粒級團聚體形成與穩(wěn)定的重要膠結(jié)劑，與 GRSP 同是土壤團聚體形成與穩(wěn)定的主要驅(qū)動因子[10]。AM 真菌等對土壤團聚體的改善會影響各粒級團聚體的 SOC 含量，也可為SOC 提供更多的物理保護，防止其被土壤生物分解[11]。但是，桑樹接種AM 真菌后其根圍土壤各粒級團聚體中的SOC 如何變化尚不清楚。而SOC 與GRSP 關系密切，二者含量提高可改善土壤團聚體穩(wěn)定性[12]。據(jù)此推測，在AM 真菌作用下桑樹根圍土壤團聚體的形成與穩(wěn)定會同時受到GRSP 和SOC 的影響。本研究選擇石漠化桑園土壤為供試土壤，分析接種AM 真菌后土壤團聚體組成與穩(wěn)定性的變化，探討 AM 真菌對SOC、GRSP 及土壤團聚體的改善效應和潛在機制，從而為巖溶區(qū)桑樹生長營造良好的土壤環(huán)境提供理論與技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌劑摩西管柄囊霉（Funneliformis mosseae）和根內(nèi)根生囊霉（Rhizophagus intraradices）由廣西農(nóng)業(yè)科學院微生物研究所提供。以河沙為基質(zhì)、三葉草（Trifolium repensL.）和玉米（Zea maysL.）為宿主進行擴繁，供試菌劑包含孢子（孢子密度為112～137 ind·10 g-1）、菌絲、侵染根段及河沙。

供試桑樹品種為桑特優(yōu) 2 號，種子用 0.5%NaClO 表面消毒20 min，無菌水沖洗若干次后播種于滅菌河沙培養(yǎng)，期間噴灑無菌水保持河沙濕潤，2個月后用于接種菌劑。桑樹無菌苗培育過程在廣西農(nóng)科院微生物研究所溫室進行。

供試土壤采自貴州省農(nóng)業(yè)科學院石漠化桑園，為石灰性土壤。土壤風干后，利用10 KGy 的鈷-60輻照滅菌。土壤主要性質(zhì)為：pH 6.70，有機質(zhì)43.63 g·kg-1，全氮 3.69 g·kg-1，全磷 0.337 g·kg-1，全鉀 3.76 g·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗于貴州省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所溫室條件下進行，設CK（對照）、Fm（接種F. mosseae）和Ri（接種R. intraradices）3 個處理，每個處理設 3個重復，共有9 盆，完全隨機排列。將滅菌后的土壤裝至塑料桶，每桶裝入滅菌土 5.0 kg、施加菌劑50 g（對照加等量的滅菌菌劑）。

具體操作過程為：先將滅菌的土壤裝至塑料桶高度的2/3 處；隨后選取 2 株長勢一致的桑苗將其根系均勻蘸滿菌劑30 g，將桑苗和剩余菌劑移入已裝滅菌土的桶中心位置；將桑苗固定后裝入剩余的滅菌土，確保成功移栽桑苗。桑苗培養(yǎng)期間，所有處理正常供水，每2 d 少量多次澆200 mL·桶-1滅菌水，生長溫度 25～28 ℃，光照時間 8～10 h·d-1。在石漠化生境中，一般持續(xù)放晴7 d 需及時為植物補充水分確保生長良好[13]。因而，本試驗對桑樹接種培養(yǎng)40 d 后不再供水，自然干旱7 d 后觀測桑樹根圍土壤團聚體狀況。

1.3 樣品采集與分析

試驗結(jié)束后，用直尺測量每個處理桑苗株高，數(shù)顯游標卡尺測量地徑。以桑苗地徑為中心，挖取其半徑5 cm、深10 cm 范圍內(nèi)土壤與根系，抖落收集根系周圍土壤后清洗根系。將每株幼苗根系剪成1 cm 長的小段用于測定AM 真菌侵染率，其測定參照 Phillips 和 Hayman[14]曲利苯藍染色法并適當改進。按 0、10%、20%、…、100%的侵染數(shù)量給出每條根段的侵染率。

土壤團聚體粒級分級采用干篩和人工濕篩相結(jié)合的方法[4，15]進行，收集各粒級土樣，50℃烘干、稱重后保存，用于各粒級土壤GRSP 和SOC 含量測定。其中GRSP 分為易提?。╡asily extractable，EE）-GRSP 和總（total，T）-GRSP 兩個組分，參考文獻[16-17]方法測定；SOC 采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定[18]。

1.4 相關計算

每個處理樣品AM 真菌侵染率的計算公式為：

土壤團聚體穩(wěn)定性以 MWD、GMD 和 PAD 反映，其計算公式如下：

式中，Wi為各級團聚體的百分含量，mi為各處理中i 級（分別為 0.25～5 mm 大團聚體、0.053～0.25 mm微團聚體和＜0.053 mm 粉黏團聚體3 個級別）團聚體質(zhì)量（g），∑mi為各處理土壤樣品總質(zhì)量（g），Xi為i 級范圍內(nèi)團聚體的平均直徑（mm）。

土壤 T-GRSP、土壤 E-GRSP 和土壤 SOC 含量的計算公式為：

式中，T-GRSPi、EE-GRSPi和 SOCi分別為 i 級土壤的T-GRSP、EE-GRSP 和SOC。

AM 真菌對土壤SOC 的效應，計算公式為：

土壤T-GRSP 和土壤E-GRSP 對土壤SOC 的占比，計算公式分別為：

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗采用SPSS 23.0 對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析、Duncan 多重比較、相關分析；用SigmaPlot 13.0繪圖。采用結(jié)構(gòu)方程模型（Structural equation modeling，SEM）中貝氏估計法解析GRSP 和SOC對團聚體形成與穩(wěn)定性的影響作用，參照吳明隆[19]所述，借助IBM SPSS Amos 21.0 執(zhí)行模型運算，過程如下：

1）根據(jù)理論文獻繪制假設的因果模型圖，即完成模型構(gòu)建；

2）開啟數(shù)據(jù)文件讀入測量指標變量，并界定潛在變量、誤差變量的變量名稱；

3）根據(jù)分析屬性選擇要呈現(xiàn)的統(tǒng)計量，需增列平均數(shù)及截距項的估計，隨后選擇貝氏估計法工具圖像按鈕執(zhí)行貝氏分析操作。

4）當貝氏估計窗口中聚斂統(tǒng)計量（Convergence statistic，C.S.）數(shù)值小于1.002 時，表示各參數(shù)估計值已達到聚斂標準，此時按下“暫停抽樣”結(jié)束估計程序。

5）根據(jù)適配測量值等判別假設模型與數(shù)據(jù)是否匹配，其中事后預測p 值（Posterior predictive p，PPp）合理范圍為0.05～0.95 之間，而當此值數(shù)據(jù)介于0.25～0.75 時表示假設模型為適配模型。

2 結(jié) 果

2.1 AM 真菌侵染率、團聚體粒級分布和穩(wěn)定性

接種AM 真菌47 d 后，桑樹根系鏡檢可觀察到菌絲和泡囊結(jié)構(gòu)，說明 AM 真菌已成功侵染。其中Fm 處理的侵染率（47.53%）顯著高于Ri（43.10%），且兩者均顯著提高桑樹的株高和地徑（表1）。圖1a顯示，Ri 處理大團聚體含量顯著增加（增幅為7.20%），F(xiàn)m 和 Ri 微團聚體含量均顯著降低（降幅分別為19.1%和50.4%），Ri 的效應更為明顯。然而，F(xiàn)m 顯著增加＜0.053 mm 粒級團聚體含量（36.4%），而Ri 對此沒有顯著影響。綜合而言，各處理不同粒級團聚體的比例由高至低依次為大團聚體、微團聚體、粉黏團聚體，而接種R. intraradices的團聚效應明顯優(yōu)于接種F. mosseae。圖1b 發(fā)現(xiàn)，與CK 對比，接種F. mosseae對MWD、GMD 和PAD 影響不明顯，但接種R. intraradices顯著增加MWD 和 GMD、顯著降低PAD。

表1 AM 真菌侵染率、桑樹株高與地徑Table 1 AM infection rate，plant height and stem diameter of mulberry relative to treatment

圖1 不同處理下土壤團聚體組成與穩(wěn)定性變化Fig. 1 Composition and stability of soil aggregates relative to treatment

2.2 土壤有機碳和球囊霉素相關土壤蛋白含量

圖2 顯示，F(xiàn)m 和Ri 處理顯著增加微團聚體SOC含量，但降低其他粒級SOC 含量。與CK 相比，F(xiàn)m顯著降低大團聚體T-GRSP 含量，對其他粒級影響不顯著；而 Ri 顯著增加大團聚體和微團聚體 T-GRSP含量，顯著降低粉黏團聚體T-GRSP 含量。同一處理各粒級間T-GRSP 含量差異顯著，其中CK 和Fm 微團聚體中最高，而Ri 表現(xiàn)為大團聚體中最高。接種F. mosseae和R. intraradices顯著增加粉黏團聚體EE-GRSP 含量，但接種R. intraradices對大團聚體和微團聚體 EE-GRSP 含量的影響顯著大于接種F.mosseae。同一處理均表現(xiàn)為微團聚體中EE-GRSP 含量最高，而粉黏團聚體中最低。表2 顯示，F(xiàn)m 和Ri對土壤有機碳的效應為負，尤其Ri 達-9.17%。土壤T-GRSP 的占比在25.5%～76.5%之間，土壤EE-GRSP的占比在4.87%～5.93%之間，并且Ri 均高于Fm。

圖2 土壤有機碳和GRSP 含量Fig. 2 Contents of soil organic carbon and glomalin-related soil protein relative to treatment

表2 不同處理下土壤有機碳變化及接種效應、土壤球囊霉素占比Table 2 Soil organic carbon，effects of AM inoculation and proportion of glomalin-related soil protein in soil organic carbon relative to treatment

2.3 有機碳、球囊霉素相關土壤蛋白對團聚體形成的影響

由圖3 中聚斂統(tǒng)計量C.S.＜1.002、事后預測 p值 PPp 介于 0.05～0.95 之間、差異信息準則DIC＞10，說明模型為適配模型。根據(jù)標準化路徑系數(shù)可知，T-GRSP、EE-GRSP 和 SOC 對各粒徑組成表現(xiàn)為正向顯著影響。效應分析結(jié)果表明（表3），各影響因子總效應表現(xiàn)為 EE-GRSP＞T-GRSP＞SOC，因而EE-GRSP 是影響團聚體組成的主要驅(qū)動因子。

圖3 GRSP、SOC 對團聚體組成影響的結(jié)構(gòu)方程模型Fig. 3 Structural equation model（SEM）showing effects of GRSP and SOC on soil aggregate composition

表3 GRSP、SOC 對土壤團聚體組成的效應分析Table 3 Effects of GRSP and SOC on soil aggregate composition

2.4 有機碳、球囊霉素相關土壤蛋白對團聚體穩(wěn)定性影響

如圖4 a—圖4c 所示，T-GRSP 顯著影響MWD、GMD 和PAD，并對SOC 有顯著的負影響作用，但SOC 對各穩(wěn)定性指標影響不顯著。EE-GRSP 和SOC對各穩(wěn)定性指標影響均不顯著（圖4 d～圖4f）。效應分析結(jié)果表明（表 4），T-GRSP 是土壤團聚體穩(wěn)定性的主要影響因子，其總效應最高。

圖4 GRSP、SOC 對團聚體穩(wěn)定性影響的結(jié)構(gòu)方程模型Fig. 4 SEM showing effects of GRSP and SOC on soil aggregate stability

表4 GRSP、SOC 對土壤團聚體穩(wěn)定性的效應分析Table 4 Effects of GRSP and SOC on soil aggregate stability

3 討 論

3.1 AM 真菌對土壤團聚體、GRSP 及SOC 的影響

干旱脅迫條件下，AM 真菌通過影響土壤大團聚體的形成和水穩(wěn)性團聚體穩(wěn)定性調(diào)節(jié)土壤結(jié)構(gòu)[20]。汪三樹等[21]研究表明，石漠化區(qū)域桑樹地梗土壤粒徑大于0.25 mm 的水穩(wěn)性團聚體含量為30.78%～45.19%，濕篩條件下距地埂30 cm 處土壤MWD 和GMD 變化范圍分別為0.507～0.785 mm 和0.220～0.315 mm。彭思利等[22]通過對小麥接種AM 真菌后，利用濕篩法對西南地區(qū)中性紫色土土壤團聚體相關指標分析表明，其中接種F. mosseae的菌根室中＞0.25 mm 水穩(wěn)性團聚體含量、MWD 和GMD 分別較根室高出15.7%、29.2%和17.9%。本研究發(fā)現(xiàn)，接種R. intraradices的桑樹根圍土壤大團聚體百分含量、MWD 和GMD 顯著提高，而PAD 顯著降低，表明 AM 真菌對土壤團聚體形成及抵抗雨水侵蝕有積極作用。這種作用可能是因為外延菌絲將土壤機械的纏繞在一起，從而影響土壤水穩(wěn)性大團聚體的形成及穩(wěn)定性[7-8]。研究表明，AM 真菌侵染率與菌絲密度呈正相關關系[16]，所接菌劑侵染率高則對土壤團聚體形成與水穩(wěn)性具有更明顯的促進作用。然而，本試驗結(jié)果與其相反，實際表現(xiàn)為接種R. intraradices侵染率低于接種F. mosseae，但對改善土壤團聚體形成及增強土壤團聚體的水穩(wěn)定性的效果最為顯著。這與植物接種 AM 真菌菌絲、孢子所釋放的GRSP 有一定關系[15]。

GRSP 廣泛存在于自然界，其黏附能力較其他碳水化合物強3 倍～10 倍，可將土壤細小顆粒膠結(jié)成較大的土壤團粒結(jié)構(gòu)，因而被稱為“超級膠水”[23]。本研究結(jié)果顯示，接種R. intraradices菌劑后，土壤大團聚體、微團聚體 T-GRSP 含量和粉黏團聚體 EEGRSP 含量均顯著提高，從而說明接種R. intraradices的桑樹根圍土壤GRSP 對大團聚體改善及穩(wěn)定性有明顯的促進作用。AM 真菌能夠分泌 GRSP，其主要成分是蛋白質(zhì)和碳水化合物，是SOC 形成的重要來源，目前已被視為土壤有機碳庫的重要組成之一[24]。本研究結(jié)果（圖 2，表 2）顯示，接種AM 真菌降低大團聚體卻增加微團聚體中SOC 含量，并且接種F. mosseae處理中T-GRSP 和EE-GRSP 含量較低，對SOC 占比有所降低，但接種R. intraradices釋放的GRSP 較多，對SOC 占比明顯較高。這說明AM 真菌與桑樹根系短期共生時，大團聚體中SOC 易分解，較不穩(wěn)定，而微團聚體對SOC 有重要的物理保護作用，增強了SOC 的固持能力。同時，接種AM 真菌對SOC 的影響，與菌劑類型及其釋放的 GRSP 含量差異顯著有關。已有研究發(fā)現(xiàn)，AM 真菌釋放的GRSP 含量與根際環(huán)境（如土壤含水量）、AM 真菌特性（如菌絲密度）密切相關[25]，后期可能需要探索不同水分條件下、不同孢子數(shù)的菌劑釋放GRSP 能力，進而對SOC 貢獻。

3.2 GRSP、SOC 對團聚體組成與穩(wěn)定性的影響機制

GRSP 和 SOC 是土壤團聚體形成的重要膠結(jié)劑。本研究結(jié)果（圖3，表3）顯示T-GRSP、EE-GRSP和SOC 對團聚體形成的直接效應均為正，并且對團聚體形成的影響顯著，從而解釋GRSP 與SOC 兩種膠結(jié)物質(zhì)能夠增強土壤團聚體的膠連作用，使微團聚體黏結(jié)在一起，進而通過菌絲體纏繞形成大團聚體[26]。并且，T-GRSP 和 EE-GRSP 對 SOC 產(chǎn)生顯著的正效應，表明SOC 受GRSP 影響。AM 真菌產(chǎn)生的 GRSP 是團聚體中有機碳組成部分之一，其濃度高低影響SOC 含量變化，進而通過 SOC 對團聚體形成產(chǎn)生間接效應[27]。因此，各膠結(jié)劑對土壤團聚體形成的影響需要綜合直接效應和間接效應進行評價，即討論總效應，其中 T-GRSP、EE-GRSP 和SOC 所產(chǎn)生的總效應分別為0.25、0.29 和0.09，表明AM 真菌參與過程中GRSP 對團聚體形成起重要作用。這可能是GRSP 包含有豐富的官能團、礦物質(zhì)、Ols、Si2p、Al2p 等元素、蛋白質(zhì)、腐殖酸等有關[28]，這些組分是土壤團聚體形成的基礎與核心[29]。同時，研究結(jié)果顯示，微團聚體組成高于粉黏團聚體，且微團聚體中GRSP 含量明顯較高，表明土壤團聚體形成過程中，作為“超級膠水”的GRSP 將土壤粉黏團聚體膠結(jié)為微團聚體，進而形成大團聚體[30]。因而，本研究較為支持Tisdall 和Oades[31]的觀點，即土壤團聚體的形成由小團聚體膠結(jié)成大團聚體，下一步研究尚需深入探索具體的形成機制。

土壤團聚體的穩(wěn)定性是其重要的物理性質(zhì)，受土壤多糖類物質(zhì)、有機質(zhì)等影響。GRSP 是 AM 真菌菌絲分泌的一種糖蛋白，本研究結(jié)果（圖4，表4）顯示 T-GRSP 對 MWD 和 GMD 的直接效應大于EE-GRSP，加上通過SOC 對各因子的間接效應后，T-GRSP 產(chǎn)生的總效應仍大于EE-GRSP。T-GRSP 對PAD 的直接效應，加上通過SOC 對PAD 的間接效應，其所產(chǎn)生的總效應小于EE-GRSP。這種因果關系整體反映桑樹接種AM 真菌后，土壤團聚體穩(wěn)定性易受 T-GRSP 影響。本研究支持了吳強盛等[15]研究觀點，即T-GRSP 和EE-GRSP 對團聚體形成與穩(wěn)定有分工上的差異，且團聚體穩(wěn)定性主要依賴 TGRSP。與 EE-GRSP 相比，T-GRSP 的性質(zhì)十分穩(wěn)定不容易發(fā)生改變，從而引起團聚體穩(wěn)定性較強[32]。同時，研究結(jié)果（圖1 和圖3）還表明，團聚體穩(wěn)定性強弱與 GRSP 分泌受到 AM 真菌類型影響，接種R. intraradices的效應明顯高于接種F.mosseae，因而在將AM 真菌用于巖溶區(qū)土壤質(zhì)量環(huán)境改善時，有必要篩選較有效的菌種，從而獲得更高的效益。

4 結(jié) 論

AM 真菌參與下桑樹根圍土壤團聚體得以改善，且接種R. intraradices易于提高大團聚體與微團聚體中T-GRSP 含量，以及粉黏團聚體EE-GRSP 含量。AM 真菌與桑樹根系短期共生時，大團聚體中SOC易分解，較不穩(wěn)定，而微團聚體對SOC 有重要的物理保護作用，增強了SOC 的固持能力。同時，接種AM真菌對SOC 的影響，與GRSP 含量差異相關，其中接種R. intraradices釋放的GRSP 較多，對SOC 占比明顯較高。此外，GRSP 對土壤團聚體的形成與穩(wěn)定影響較大，其中土壤團聚體形成主要依賴于EE-GRSP，而穩(wěn)定性受T-GRSP 影響最大。在將AM 真菌用于巖溶區(qū)土壤質(zhì)量環(huán)境改善時，有必要篩選較有效的菌種，從而獲得更高的效益。