集約經(jīng)營對(duì)毛竹林土壤反硝化細(xì)菌豐度的影響*

曹林樺，劉彩霞，劉 茗，方 偉，梁辰飛，秦 華，陳俊輝，徐秋芳?

（1. 浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江臨安 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，浙江臨安311300）

反硝化作用是土壤氮素循環(huán)過程中的重要一環(huán)，是指反硝化微生物在厭氧的條件下，通過一系列的酶催化還原反應(yīng)，先將轉(zhuǎn)化為，然后再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮（NO，N2O，N2）的過程[1]。反硝化作用不僅會(huì)導(dǎo)致氮肥損失，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)危害。同時(shí)反硝化作用過程釋放的N2O 是三大溫室氣體之一，其產(chǎn)生的溫室效應(yīng)約是CO2的300 倍[2]。此外，N2O 還會(huì)對(duì)臭氧層造成極大的破壞，增加皮膚癌的患病概率[3]。雖然硝化和反硝化過程均能產(chǎn)生N2O。但與硝化過程不同的是，N2O 是反硝化過程中的必要產(chǎn)物，甚至是終產(chǎn)物[4]，而且有大量研究表明亞熱帶酸性森林土壤中由反硝化作用產(chǎn)生的N2O 大于硝化作用[5]。雖然反硝化微生物主要分布在水體、沉積物和土壤等環(huán)境[6]，但由于土壤的環(huán)境更適合微生物生存，微生物多樣性更為豐富，而且土壤中氮含量普遍較水體、沉積物高，因此，研究土壤微生物反硝化作用對(duì)于減少氮肥損失，降低N2O 排放均有著重要的意義。

反硝化作用是一個(gè)由四步反應(yīng)所構(gòu)成的生物地球化學(xué)過程，包括還原、還原、NO 還原和N2O 還原。其每個(gè)步驟均由相應(yīng)細(xì)菌的代謝合成酶催化完成。

毛竹林土壤屬于旱地土壤，雖然總體為好氧環(huán)境，但土壤中存在大小不等的孔隙，微小孔隙的局部環(huán)境也可能是厭氧的。故在此種土壤環(huán)境中也會(huì)有相應(yīng)的反硝化過程存在。然而已有的大多數(shù)研究均圍繞著不同樹種森林[8]、沙漠[9]、草原[10]等其他生態(tài)系統(tǒng)展開。有關(guān)毛竹林反硝化過程微生物的變化情況少見報(bào)道。

毛竹是我國重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)竹種，具有生長周期短、產(chǎn)量高、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn)。為追求更高的經(jīng)濟(jì)效益，人們對(duì)原來以粗放經(jīng)營為主的毛竹林進(jìn)行了集約化經(jīng)營。集約經(jīng)營的主要措施有施肥、去除林下植被、翻耕等。這種集約經(jīng)營模式雖然提高了毛竹的產(chǎn)量，但人為耕作導(dǎo)致水土流失加劇，使土壤出現(xiàn)不同程度的退化[11]。與此同時(shí)，長期集約經(jīng)營降低了土壤微生物的活性[12]，這也促使人們加大了對(duì)集約經(jīng)營過程中土壤微生物相關(guān)生態(tài)變化的關(guān)注[13-15]。然而，與碳氮循環(huán)密切相關(guān)的反硝化微生物的研究少見報(bào)道。許多研究證明氮肥施用后因硝化作用產(chǎn)生大量N2O[16]，集約經(jīng)營毛竹林土壤是否存在反硝化微生物？是否也會(huì)導(dǎo)致排放N2O 等問題值得探索。本文以nirK、nirS和nosZ3 個(gè)基因?yàn)檠芯繉?duì)象，運(yùn)用定量PCR 的方法初步探究集約經(jīng)營過程中毛竹林土壤3 種功能基因豐度的變化，研究結(jié)果對(duì)毛竹林經(jīng)營管理具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)遂昌縣位于浙江省西南部（28°13′—18°49′N，118°41′—119°30′E）。屬中亞熱帶季風(fēng)類型，全年平均氣溫16.8 ℃，年降水量1 510 mm，降水天數(shù)172 d，年無霜期251 d。土壤母巖為由花崗巖變質(zhì)而成的片麻巖石，土層厚度大于 1 m，坡度為20°～25°。毛竹密度約為 1 800 株·hm-2，1989 年之前為竹林開發(fā)階段，僅開墾、劈山，不施肥。該階段毛竹林下主要有 9 種植被，其中狗脊蕨（Woodwardia japonica） 和 兔 兒 傘 （Syneilesis aconitifolia）蓋度為 90%。1989—2000 年施肥方法為：大年（留養(yǎng)新竹年）6 月在每株毛竹的上方開環(huán)形溝，施用尿素（或碳銨）450 kg·hm-2；2000—2010 年施用配方肥，每年用量為尿素450 kg·hm-2、過磷酸鈣 380 kg·hm-2、氯化鉀 75 kg·hm-2；2010 年之后每年施用毛竹專用肥（福建中化生產(chǎn)）750 kg·hm-2和尿素 450 kg·hm-2。集約經(jīng)營過程毛竹林下基本無灌木雜草，毛竹平均密度約3 250 株·hm-2。

1.2 樣品采集與處理

于2013 年9 月按照生態(tài)控制原則，選擇生長歷史一致但集約經(jīng)營時(shí)間不同的毛竹林，采用隨機(jī)取樣法采集不同經(jīng)營年限毛竹林表層（0～20 cm）和亞表層（20～40 cm）的土壤樣品。該毛竹林地均位于同一山頭，并由同一農(nóng)戶經(jīng)營，采取的施肥管理措施也均一致。集約經(jīng)營的時(shí)間分別為：0 a（對(duì)照組）、10 a、15 a、20 a 和25 a。每個(gè)年份分別選擇3個(gè)樣地，即3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)樣地采用S 型取樣法選取5 個(gè)樣品點(diǎn)就地混合為一個(gè)樣品，分別采集表層（0～20 cm）、亞表層（20～40 cm）的土樣，過篩（2 mm）后裝入密封袋，將樣品放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。樣品共分為2 份，1 份放入-70℃冰箱，經(jīng)冷凍干燥后，提取土壤細(xì)菌總DNA，用于分子生物學(xué)分析；另一份于室內(nèi)自然風(fēng)干，充分研磨過篩后用于土壤基本理化性質(zhì)的測定。

1.3 分析方法

土壤理化性質(zhì)分析：土壤理化性質(zhì)分析方法參考《土壤農(nóng)化分析》[17]。土壤pH 采用酸度計(jì)測定，土水比為 2.5︰1；有機(jī)碳含量采用重鉻酸鉀-濃硫酸油浴外加熱法測定；土壤全氮含量采用半微量凱式滴定法測定；堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測定；有效磷含量采用鹽酸-氟化銨溶液浸提，鉬銻抗比色法測定；速效鉀含量采用醋酸銨提取，火焰光度計(jì)測定；硝態(tài)氮含量采用氯化鉀浸提，紫外分光光度計(jì)測定；銨態(tài)氮含量采用氯化鉀浸提，靛酚藍(lán)比色法測定。

土壤總 DNA 提?。翰捎?Power Soil DNA Isolation Kit 試劑盒提取土壤總DNA。稱取0.50 g 保存于-70 ℃冰箱，經(jīng)冷凍干燥后，按試劑盒說明書進(jìn)行提取。DNA 提取成功后經(jīng)1%（m/v）的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 片段大小，并用微量分光光度計(jì)檢測其濃度和純度。提取后的DNA 樣品保存于-40℃。

土壤反硝化細(xì)菌質(zhì)粒制備：以土壤樣品 DNA為模板分別對(duì)nirK、nirS、nosZ三種功能基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如表1 所示。PCR 產(chǎn)物用純化試劑盒（Takara）純化后與PEASY-T3 Vector（全式金生物技術(shù)公司，北京）連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞中，并涂在含有X-gal、IPTG 和 Amp 的 LB 瓊脂平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，用菌落PCR 方法檢測陽性克隆子。對(duì)陽性克隆子用LB 液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，最后用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒。

表1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中的引物及反應(yīng)條件Table 1 Primers and PCR condition used for the PCR amplification

土壤反硝化細(xì)菌相關(guān)功能基因熒光定量PCR：采用引物 FlaCu：R3Cu、Cd3aF：R3cd、Lb：Rb 分別對(duì)nirK、nirS、nosZ三種功能基因進(jìn)行基因片段擴(kuò)增，定量 PCR 在熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 儀（Bio-Red,USA）上進(jìn)行。反應(yīng)體系為 20 μL，反應(yīng)體系如下：2×Premix Ex Taq 10 μL，50 μmoL·L-1上游和下游引物各0.2 μL，模板DNA1.0 μL，無菌雙蒸水8.6 μL。三種功能基因熒光定量PCR 條件相同，均為:95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸 20 s，35 個(gè)循環(huán)，溶解曲線過程（65℃至95℃，0.5℃·5 s-1）。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：三種功能基因質(zhì)粒 DNA 經(jīng) Nanodrop?ND-1000 測定，nirK、nirS和nosZ基因重組質(zhì)粒濃度分別為105.6、102.5、135.2 ng·μL-1，計(jì)算其拷貝數(shù)分別為 2.74×1010、2.70×1010、3.74×1010copies·μL-1，以 10 倍梯度對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋（ 10-3～10-8），每個(gè)梯度3 次重復(fù)，nirK、nirS和nosZ決定系數(shù)（R2）分別為 0.995、0.998 和 0.999。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Microsoft Excel 2016 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Origin 7.5 軟件作圖，采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和最小顯著差數(shù)（LSD）法進(jìn)行顯著性和多重比較（α=0.05），采用皮爾遜（Pearson）法進(jìn)行相關(guān)性分析。通過Canoco 4.5 結(jié)合環(huán)境因子分析微生物功能基因豐度的變化。

2 結(jié) 果

2.1 集約經(jīng)營毛竹林土壤理化性質(zhì)

有關(guān)毛竹集約經(jīng)營土壤理化性質(zhì)變化已有報(bào)道[15]。簡要概括：毛竹集約經(jīng)營過程中土壤理化性質(zhì)變化，表層土壤 pH 呈下降趨勢；有機(jī)碳、全氮含量于經(jīng)營10 a 達(dá)到最大（P＜0.05），其余年份無顯著差異；堿解氮呈現(xiàn)先上升再下降后又上升的波動(dòng)變化規(guī)律；碳氮比經(jīng)營初期緩慢上升，15 a 時(shí)達(dá)到最大，20 a 顯著下降（P＜0.05）；有效磷和速效鉀總體呈上升趨勢；硝態(tài)氮出現(xiàn)先減少后增加的變化規(guī)律，而銨態(tài)氮在整個(gè)經(jīng)營過程中變化不大。

與表層土壤不同的是，集約經(jīng)營前期亞表層毛竹土壤pH 沒有發(fā)生明顯變化，而在第25 年時(shí)顯著下降 0.42 個(gè) pH 單位（P＜0.05）；全氮和堿解氮均在經(jīng)營25 a 之后顯著增加（P＜0.05）；有機(jī)碳含量在經(jīng)營10 a 和25 a 顯著增加（P＜0.05），而在經(jīng)營20 a 顯著下降（P＜0.05）。其余理化因子變化與表層相同。

2.2 集約經(jīng)營對(duì)毛竹林土壤反硝化細(xì)菌功能基因豐度的影響

采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析集約經(jīng)營毛竹林土壤反硝化細(xì)菌豐度結(jié)果表明，nirK基因數(shù)量在2.62×107～1.28×108copies·g-1干土之間，隨著集約經(jīng)營時(shí)間的持續(xù)，表層土壤nirK基因數(shù)量呈現(xiàn)周期性波動(dòng)態(tài)勢（圖1A），上升過程發(fā)生在集約經(jīng)營10 a和20 a 的2 個(gè)時(shí)間，其基因豐度顯著大于其他年份（P＜0.05），集約經(jīng)營15 年時(shí)豐度達(dá)到最低值，顯著小于其他年份（P＜0.05），第 25 年時(shí)的基因豐度與對(duì)照組無顯著性差異。而亞表層土壤的nirK豐度變化呈V 字型，集約經(jīng)營15 a 時(shí)才開始下降、20 a 時(shí)達(dá)到低谷，土壤nirK基因數(shù)量在15 a 和20 a 分別較對(duì)照下降43%和63%（P＜0.05），25 a 時(shí)又恢復(fù)至對(duì)照水平，集約經(jīng)營10 a 和25 a 與對(duì)照無顯著性差異。nirS基因數(shù)量在 1.45×106～4.96×107copies·g-1干土之間，總體低于nirK基因。表層土壤基因數(shù)量在集約經(jīng)營 10 a 顯著上升 41%（P＜0.05），之后一直保持較高的水平（圖 1B），說明集約經(jīng)營促進(jìn)表層土壤中攜帶nirS基因微生物的繁殖。土壤亞表層nirS基因數(shù)量則在前20 a 的集約經(jīng)營過程中呈下降趨勢，第20 年最大下降幅度為63%，而第25 年則恢復(fù)到對(duì)照水平。nosZ基因數(shù)量在 3.81×107～3.03×108copies·g-1干土之間。表層土壤基因豐度在集約經(jīng)營10 a 明顯增加，第15 年時(shí)開始下降，集約經(jīng)營 20 a 較對(duì)照低 70%，之后則變化不大（P＞0.05）。亞表層土壤nosZ基因豐度前 10 年變化不大（圖1C），第15 年和20 年分別降低34%和48%，顯著低于對(duì)照和 10 a 土壤（P＜0.05），第 25 年時(shí)nosZ基因豐度恢復(fù)、且數(shù)量顯著高于對(duì)照（增加35%，P＜0.05）。集約經(jīng)營過程中表層土壤的（nirK+nirS）/nosZ比率為 0.34～1.08，在亞表層為1.63～2.27。表層（nirK+nirS）/nosZ的比率在集約經(jīng)營20 a 顯著增加，而亞表層中顯著降低。

圖1 長期集約經(jīng)營毛竹林土壤反硝化細(xì)菌nirK、nirS、nosZ 功能基因豐度Fig. 1 Abundance of nirK，nirS，nosZ genes in the soils of the moso bamboo plantations under long-term intensive management

2.3 土壤理化性質(zhì)對(duì)反硝化細(xì)菌功能基因豐度的影響

集約經(jīng)營主要通過土壤性質(zhì)的改變來影響土壤微生物。為揭示土壤性質(zhì)對(duì)反硝化細(xì)菌豐度的影響，將表層與亞表層土壤的三個(gè)功能基因的豐度分別與對(duì)應(yīng)的土壤理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表 2所示。在表層土壤中，nirK基因數(shù)量與全氮呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），nirS基因與有效磷呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），而nosZ基因則與有機(jī)碳和碳氮比呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）、與速效鉀和硝態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），說明影響表層土壤三個(gè)功能基因豐度的主要因素并不一致。作為 N2O 排放量指標(biāo)[21]的（nirK+nirS）/nosZ比值與碳氮比呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）、與速效鉀和硝態(tài)氮呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。在亞表層土壤中，三種功能基因均與有機(jī)碳呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），nosZ基因還與全氮和堿解氮含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。（nirK+nirS）/nosZ的比值與硝態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

表2 毛竹林土壤反硝化功能基因與環(huán)境參數(shù)之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)Table 2 Pearson’s correlations（r）between denitrifying functional gene abundance and environmental parameters in the moso bamboo plantation

為了進(jìn)一步揭示集約經(jīng)營過程中土壤性質(zhì)對(duì)反硝化功能基因豐度變化的影響，將表層以及亞表層土壤的反硝化功能基因豐度分別與對(duì)應(yīng)土層的理化性質(zhì)作為兩組變量進(jìn)行冗余分析（RDA，Redundancy analysis）。根據(jù)蒙特卡洛檢驗(yàn)，選取影響較大的 4個(gè)環(huán)境因子分析結(jié)果表明，表層土壤中第一排序軸和第二排序軸分別解釋了 25.8%和 23.6%的變異（圖 2A），第一排序軸將 CK 和10 年樣品與20 年和25 年樣品很好地區(qū)分開來，而 15 年樣品則在第二坐標(biāo)軸附近，說明集約經(jīng)營過程中土壤反硝化功能基因豐度變化分為三個(gè)階段。第一排序軸與碳氮比呈正相關(guān)、與硝態(tài)氮和速效鉀呈負(fù)相關(guān)，第二排序軸與全氮呈負(fù)相關(guān)。土壤硝態(tài)氮（F=3.855，P=0.024）、碳氮比（F=3.832，P=0.022）、速效鉀（F=2.844，P=0.050）對(duì)土壤反硝化細(xì)菌功能基因豐度的影響均達(dá)顯著水平，而全氮（F=2.646，P=0.054）則接近顯著水平。進(jìn)一步分析可得，硝態(tài)氮和速效鉀對(duì) 20 年和 25 年樣地反硝化細(xì)菌影響最大。nirK與全氮呈顯著正相關(guān)，nosZ與硝態(tài)氮和速效鉀呈顯著負(fù)相關(guān)，這與相關(guān)性分析結(jié)果相同。

圖2 集約經(jīng)營毛竹林土壤反硝化功能基因豐度與環(huán)境參數(shù)的冗余分析Fig. 2 Redundancy analysis of abundance of denitrifying functional genes and environmental parameters in soils of the moso bamboo plantation under intensive management

根據(jù)蒙特卡洛檢驗(yàn)，選取亞表層土壤中影響較大的4 個(gè)環(huán)境因子分析結(jié)果表明，第一排序軸和第二排序軸分別解釋了66%和1.7%的變異，第一排序軸上三個(gè)功能基因與有機(jī)碳相關(guān)性很強(qiáng)（圖 2B）。不同集約經(jīng)營時(shí)間的土壤均聚焦在一起（一個(gè)對(duì)照重復(fù)外），但分組情況與表層土壤不同，15 年和20年聚在一組、位于第一排序軸正值區(qū)，其他3 個(gè)年份組位于第一排序軸的負(fù)值區(qū)，且25 年又與CK 和10 年在第二排序軸分開。說明集約經(jīng)營時(shí)間對(duì)3 個(gè)反硝化功能基因影響顯著，其中影響最大是有機(jī)碳和銨態(tài)氮，與第一排序軸呈負(fù)相關(guān)，有機(jī)碳（F=14.717，P=0.002）達(dá)到顯著水平，而銨態(tài)氮（F=2.795，P=0.092）則沒有；其次為堿解氮和碳氮比，分別與第二排序軸呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)，但均未達(dá)到顯著水平（堿解氮 F=2.315，P=0.114、碳氮比F=1.811，P=0.181）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，堿解氮對(duì)集約經(jīng)營25 年樣地有積極影響，有機(jī)質(zhì)與3 種功能基因均呈顯著正相關(guān)，全氮和堿解氮與nosZ功能基因呈正相關(guān)。

3 討 論

前人的研究結(jié)果證明，影響土壤反硝化作用的因素比較多，而且各因素之間互為影響，主要影響因子包括速效氮、有機(jī)碳、土壤水分、溫度、pH 以及土壤質(zhì)地等[22]。理論推測以及研究證明，單因素的速效氮[23]、有機(jī)碳[24]、土壤水分[23]、溫度[25]、pH[26]與反硝化作用均有正相關(guān)關(guān)系，而自然或人為耕作土壤的土壤性質(zhì)變化不一致（不同步），因此，實(shí)際測量得到的反硝化基因豐度變化是多個(gè)因素綜合作用的結(jié)果。由于不同因素的作用強(qiáng)度不同，正反作用可能會(huì)抵消、或者作用強(qiáng)的因子將弱的因子掩蓋掉。

3.1 集約經(jīng)營對(duì)毛竹林表層和亞表層反硝化基因的總體影響

毛竹林土壤的反硝化基因nirK、nirS和nosZ豐度總體較報(bào)道的結(jié)果高（圖1），除旱地農(nóng)田nirS外，水稻田、杉木林和旱地農(nóng)田中的三種功能基因豐度均顯著低于毛竹林或與毛竹林持平[27-29]。這表明毛竹林土壤含有更高的反硝化基因豐度，因此相比其他土地利用方式可能N2O 排放量較高。集約經(jīng)營措施主要措施有施肥、去除林下植被、翻耕等。由此，集約經(jīng)營過程中土壤速效養(yǎng)分水平提高，土壤通氣性增加，pH 下降，有機(jī)碳含量不斷波動(dòng)。其中 pH下降的原因在于集約經(jīng)營過程中大量氮肥的施用，而有機(jī)碳含量不斷變化的原因在于一方面集約經(jīng)營初期施肥結(jié)合翻耕促進(jìn)土壤中地下根鞭的分解，另一方面施肥促進(jìn)毛竹生長，增加毛竹根系分泌物量，從而提高了土壤的有機(jī)質(zhì)含量。而10 年后不斷翻耕施肥導(dǎo)致有機(jī)碳含量下降。25 年有機(jī)質(zhì)又有小幅回升，這可能與毛竹生產(chǎn)量提高后，枯落物和根系分泌物的增加有關(guān)。隨著集約經(jīng)營時(shí)間的增加，三種反硝化基因的變化表現(xiàn)出一定的規(guī)律性，無論是表層還是亞表層土壤，三種功能基因豐度在集約經(jīng)營10 年時(shí)增加或保持不變，說明在前 10 年期間毛竹林集約經(jīng)營措施對(duì)反硝化細(xì)菌沒有產(chǎn)生不良影響，有的還有促進(jìn)作用。盡管有研究表明酸性范圍內(nèi)土壤 pH 越低，反硝化細(xì)菌豐度也會(huì)隨之降低[26]。而在本研究中有機(jī)碳、全氮和堿解氮明顯增加對(duì)反硝化作用的正作用抵消了 pH 下降的負(fù)面影響，從而掩蓋了 pH 下降帶來的不利影響。土壤硝態(tài)氮下降是反硝化作用增強(qiáng)導(dǎo)致底物減少的結(jié)果（表1）。這與斐自偉等[30]的研究結(jié)果相似。除表層土壤nirS基因外，三種功能基因在集約經(jīng)營過程的某一階段出現(xiàn)不同程度的下降，但集約經(jīng)營持續(xù)25 年時(shí)，除了nosZ表層功能基因外，其他反硝化功能基因豐度均恢復(fù)到對(duì)照甚至超過對(duì)照的水平（圖1）。10 年之后土壤有機(jī)碳及pH 明顯低于對(duì)照和10 年土壤，這可能是導(dǎo)致反硝化基因豐度下降的主要原因。而在25年反硝化基因豐度回升可能是由于有機(jī)碳含量的上升。由于土壤因子變化較復(fù)雜，將土壤性質(zhì)與基因豐度進(jìn)行相關(guān)性和冗余分析以揭示內(nèi)在規(guī)律，相關(guān)分析表明，nirK和nirS基因豐度與不同土層土壤性質(zhì)的相關(guān)性沒有一致的規(guī)律，而nosZ基因豐度在表層和亞表層均與有機(jī)碳顯著相關(guān)。表層和亞表層土壤pH 和銨態(tài)氮與所有基因均沒有顯著相關(guān)性（表2），其他指標(biāo)則分別或同時(shí)與某一土層的某個(gè)基因表現(xiàn)出顯著相關(guān)性，其中單因子有機(jī)碳、全氮以及它們的比值（C/N）與反硝化基因相關(guān)的頻率最高。冗余分析表明，表層土壤的硝態(tài)氮、C/N、速效鉀以及全氮含量等4 個(gè)因子對(duì)3 個(gè)反硝化基因影響的顯著水平依次遞減，而對(duì)亞表層影響較大的4 個(gè)因子依次為：有機(jī)碳、銨態(tài)氮、堿解氮以及 C/N，不同土層驅(qū)動(dòng)基因豐度變化的主要土壤性質(zhì)不同，而C/N 同時(shí)影響兩個(gè)土層，且兩個(gè)土層分別同時(shí)出現(xiàn)2 個(gè)含氮指標(biāo)，說明集約經(jīng)營措施主要通過土壤氮和有機(jī)碳綜合影響反硝化微生物的活動(dòng)和功能。由于所有土壤的質(zhì)地相同，集約經(jīng)營措施是每年去除林下植被、翻耕，故不同集約經(jīng)營時(shí)間的土壤疏松度差別不大，因此，土壤化學(xué)性質(zhì)變化是影響基因豐度的主要因素。

3.2 集約經(jīng)營過程中表層和亞表層反硝化基因的差異

為弄清土層深度對(duì)不同反硝化基因的影響，我們對(duì)不同土層之間各種基因豐度差異情況展開討論。表層nirS和nosZ土壤基因豐度顯著高于亞表層土壤，但nirK基因豐度出現(xiàn)相反現(xiàn)象。大部分研究報(bào)道表層土壤反硝化基因豐度高于亞表層土壤，nirK、nirS和nosZ豐度在不同類型土壤如耕地[31]、草地[32]和森林[33]中均隨著深度的增加而降低。雖然亞表層土壤的氧化還原電位通常較表層低，有利于反硝化作用，但表層土壤有機(jī)碳高于亞表層，可能對(duì)反硝化作用的影響更大。為什么亞表層土壤的nirK基因豐度反而高于表層的異?，F(xiàn)象？從前面分析得知，毛竹林集約經(jīng)營土壤反硝化細(xì)菌豐度變化受到氮素水平和有機(jī)碳的影響最大，而亞表層土壤的氮素水平和有機(jī)碳均低于正常表層，從土壤性質(zhì)解釋不通。推測可能是分布在30 cm 亞表層的毛竹竹鞭分泌大量可溶性有機(jī)碳，對(duì)攜帶nirK基因的微生物促進(jìn)效果較nirS和nosZ基因微生物更加顯著。李振高等[34]也發(fā)現(xiàn)在小麥生長過程中隨著根系分泌物的增加反硝化細(xì)菌數(shù)量不僅顯著增加，同時(shí)根系分泌物還刺激了反硝化細(xì)菌的代謝活動(dòng)。此外，研究證明pH 與nirK反硝化基因豐度呈顯著正相關(guān)[26]，而在本研究中表層pH 顯著低于亞表層，因此pH 也可能是導(dǎo)致nirK表層和亞表層豐度出現(xiàn)異常的原因之一。

3.3 集約經(jīng)營過程中不同反硝化基因之間的差異

本研究中，反硝化基因nirK、nirS和nosZ等隨著集約經(jīng)營時(shí)間的變化規(guī)律不同。盡管表層土壤中nirK和nirS兩種功能基因共同編碼亞硝酸還原酶，且豐度上有著相同的數(shù)量級(jí)，但毛竹集約經(jīng)營過程中兩種nir基因變化趨勢不同，且分別受不同的土壤理化因子的控制。關(guān)于這兩種基因的同步[35]和反向[36]變化規(guī)律的結(jié)果均有報(bào)道。由于土壤中攜帶反硝化nirK和nirS的微生物屬于不同的種[7]，在環(huán)境中有各自的生態(tài)位[27]，對(duì)同一環(huán)境因子的響應(yīng)可能不同。有時(shí)可能存在競爭關(guān)系[36]、有時(shí)候存在正相關(guān)關(guān)系[35]，有時(shí)則互不影響[26]，三種關(guān)系均有可能發(fā)生。毛竹林表層土壤中nirK和nirS無顯著相關(guān)性，屬于互不影響的關(guān)系，這可能是因?yàn)閚irK豐度在整個(gè)集約過程中的波動(dòng)遠(yuǎn)大于nirS。研究表明nirK對(duì)環(huán)境的敏感程度要遠(yuǎn)大于nirS[37]。而集約經(jīng)營過程中由于施肥、毛竹凋落物、翻耕等抗干擾活動(dòng)導(dǎo)致微生物的生境不斷變化，可以很好地解釋nirK基因豐度波動(dòng)大于nirS的結(jié)果。與nirK和nirS變化規(guī)律不同，集約經(jīng)營過程中表層和亞表層土壤的nosZ基因豐度均表現(xiàn)為先增加后減少的一致規(guī)律，且與有機(jī)碳含量呈顯著正相關(guān)；表層土壤nosZ豐度與速效鉀和硝態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)、而亞表層土壤nosZ豐度則與碳氮比呈顯著正相關(guān)，說明有機(jī)碳是影響nosZ豐度的共性因子，研究表明[38]隨著氮肥施用量增加，土壤碳氮比降低，土壤中反硝化微生物nosZ的豐度顯著降低。毛竹林在集約經(jīng)營初期由于施肥促進(jìn)有機(jī)質(zhì)分解以及促進(jìn)毛竹生長使毛竹分泌根系分泌物增加，因而，土壤有機(jī)質(zhì)含量明顯增加，雖然施肥增加土壤氮水平，但增幅小于有機(jī)碳，因此，土壤碳氮比總體升高有利于攜帶nosZ基因的微生物活動(dòng)。而長期集約經(jīng)營碳氮比顯著低于對(duì)照，nosZ基因豐度同碳氮比一樣呈現(xiàn)同步變化的趨勢。

3.4 集約經(jīng)營過程中（nirK+nirS）/nosZ 比值變化

研究發(fā)現(xiàn)（nirK+nirS）/nosZ比值可預(yù)測 N2O排放的變化，相同基因豐度水平情況下比值越高產(chǎn)生的 N2O 越多[21]。表層土壤（nirK+nirS）/nosZ比值在集約經(jīng)營初期變幅不大，而在集約經(jīng)營后期顯著上升（圖 1D），說明隨著集約經(jīng)營時(shí)間可能會(huì)增加N2O 排放。表層后期nosZ基因降幅較大（圖1C）而nirS基因則沒有下降（圖 1B），因此造成（nirK+nirS）/nosZ比值明顯增加。集約經(jīng)營后期硝態(tài)氮明顯積累，為反硝化作用提供豐富的底物，反硝過程可以保持在較高水平，而nosZ基因數(shù)量顯著減少使硝化過程不能徹底還原為N2，導(dǎo)致N2O 排放量增加。nosZ基因數(shù)量減少主要受到與硝態(tài)氮積累有關(guān)，研究表明[23]高濃度的硝態(tài)氮會(huì)抑制N2O 還原酶（nosZ）的活性，使 N2O 轉(zhuǎn)化為 N2速率減慢。亞表層土壤由于nirK明顯高于表層、而nosZ則明顯低于表層，導(dǎo)致（nirK+nirS）/nosZ比值顯著高于表層（圖 1D），但隨著集約經(jīng)營時(shí)間呈緩慢下降趨勢。從3 個(gè)基因豐度變化情況看，亞表層土壤對(duì)nosZ基因的影響大于（nirK+nirS），說明亞表層土壤反硝化步驟主要為還原形成NO，因而產(chǎn)生較多的N2O。然而，亞表層土壤（nirK+nirS）/nosZ的比值在集約經(jīng)營后期顯著降低，這正好與表層的變化規(guī)律相反、呈顯著負(fù)相關(guān)。亞表層土壤（nirK+nirS）/nosZ與硝態(tài)氮濃度呈顯著負(fù)相關(guān)，這可能是由于土壤亞表層相比表層硝態(tài)氮濃度更低，故在集約經(jīng)營后期并未抑制N2O 還原酶活性。以上結(jié)果推測，整個(gè)集約經(jīng)營過程亞表層土壤反硝化產(chǎn)生的N2O 均高于表層，表層土壤集約經(jīng)營后期N2O 排放量增加。

4 結(jié) 論

反硝化作用是竹林土壤氮循環(huán)的重要一環(huán)。隨著集約經(jīng)營時(shí)間的增加，兩層土壤的三種功能基因豐度在集約經(jīng)營 10 年時(shí)表現(xiàn)增加或不變的一致規(guī)律。除表層土壤nirS基因外，三種功能基因在集約經(jīng)營過程的某一階段（15 或 20 年）出現(xiàn)不同程度的下降，集約經(jīng)營持續(xù)25 年時(shí)，除nosZ表層土壤基因豐度仍低于對(duì)照，其他不同土層土壤基因豐度均恢復(fù)甚至超過對(duì)照水平，說明土壤反硝化細(xì)菌表現(xiàn)出對(duì)集約經(jīng)營干擾的抵抗和恢復(fù)反應(yīng)。集約經(jīng)營措施主要通過土壤氮和有機(jī)碳變化綜合影響反硝化細(xì)菌的活動(dòng)和功能。毛竹林集約經(jīng)營土壤的反硝化細(xì)菌積極參與氮循環(huán)過程，加劇N2O 溫室氣體的排放。建議在集約經(jīng)營過程中，通過施用緩釋肥料以減少反硝化細(xì)菌的底物硝酸根。