稻田生物固氮研究進(jìn)展及方向*

謝祖彬，張燕輝，王 慧

（1. 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

稻田生態(tài)系統(tǒng)具有保持土壤肥力、提供糧食保障和生態(tài)調(diào)節(jié)等多種功能。目前全球水稻種植面積達(dá)1.45 億hm2，是世界約1/2 人口的主要糧食；我國(guó)水稻土面積約3 000 萬(wàn)hm2，約占全國(guó)耕地面積的1/4，是我國(guó)60%人口的主要糧食。在不施氮肥條件下，種植水稻提供的蛋白質(zhì)是種植玉米的1.5 倍[1-2]，其主要原因是稻田生態(tài)系統(tǒng)能進(jìn)行生物固氮而不斷為水稻生長(zhǎng)提供氮素[3]。稻田還具有蓄水防洪、涵養(yǎng)地下水源、氣溫調(diào)節(jié)、水質(zhì)凈化、生物多樣性維持和景觀文化價(jià)值等功能[4]。

沒(méi)有氮素就沒(méi)有生命。氮是生物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵生命元素，又是陸地生態(tài)系統(tǒng)最不能滿足生物生長(zhǎng)需要的元素。在合成氨技術(shù)發(fā)明以前，生物固定的氮是陸地生態(tài)系統(tǒng)氮的主要來(lái)源。生物固氮是固氮微生物在固氮酶催化下將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化成氨的過(guò)程。自1913 年 Haber-Bosch 合成氨技術(shù)發(fā)明以來(lái)，人工合成氨不斷增加，到2010 年達(dá)到1.2億噸N[5]，但陸地生態(tài)系統(tǒng)每年固氮量估計(jì)約為1.6億～4億噸，其中自然生態(tài)系統(tǒng)固氮1億～2.9 億噸[6]，農(nóng)田每年固氮6 000 萬(wàn)噸～1 億噸（豆類作物每年固氮2 150 萬(wàn)噸，草地、稻田等其他農(nóng)田固氮約3 870萬(wàn)～7 100 萬(wàn)噸）[7]。可見，無(wú)論過(guò)去、現(xiàn)在或?qū)?lái)生物固定的氮均為陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要氮源。

考古資料表明大約7 000 年前亞洲開始種植水稻，3 100 年前中國(guó)開始種植大豆。大約2 100 年前，我國(guó)勞動(dòng)人民就初步總結(jié)了生物固氮的基本現(xiàn)象，古農(nóng)籍《汜勝之書》記載了“瓜與小豆間作”為宜的耕作方式，反映了古代勞動(dòng)人民對(duì)生物固氮的樸素認(rèn)識(shí)；1838 年Boussingault 發(fā)現(xiàn)豆科作物能將活性氮（相對(duì)于惰性N2而言）富集在土壤中，并認(rèn)為豆科作物能生產(chǎn)活性氮，但仍然不知道為什么水稻和大豆能增加氮素供給。直至1888 年，Herman Hellriegel 和Hermann Wilfarth 才發(fā)現(xiàn)土壤中微生物參與了生物固氮過(guò)程，而且與豆科作物存在共生關(guān)系[3]。稻田的淹水環(huán)境為光合固氮菌和異養(yǎng)固氮菌的生物固氮提供了合適的pH、氧化還原狀況等條件[8]。本文擬對(duì)稻田生物固氮研究方法、固氮量、固氮微生物、影響因素、調(diào)控及其研究方向進(jìn)行綜述，以期為稻田生物固氮研究提供幫助。

1 稻田生物固氮類型

生物固氮一般分為共生固氮（symbiotic biological N2fixation）、聯(lián)合固氮（plant-associated biological N2fixation）和自生固氮（free-living biological N2fixation）[7]。共生固氮是固氮微生物與能進(jìn)行光合作用的生物生活在一起，利用光合生物提供的碳水化合物為能源，并利用其驅(qū)動(dòng)固氮酶將大氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為氨，并反過(guò)來(lái)為光合生物提高氮素的過(guò)程，典型的有豆科植物-根瘤菌共生、滿江紅-魚腥藍(lán)細(xì)菌共生。聯(lián)合固氮是固氮微生物與植物生活在一起，不形成根瘤，以植物提供的碳水化合物為能源，并反過(guò)來(lái)為植物提高氮素和（或）激素類物質(zhì)而進(jìn)行的固氮過(guò)程，如甘蔗-固氮螺菌（Azospirillum）聯(lián)合固氮。自生固氮是自由生長(zhǎng)的固氮微生物獨(dú)立進(jìn)行的固氮過(guò)程，如藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）、褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）和梭菌（Clostridium prazmowski）。

在本文中，我們將生物固氮主要分為豆科生物固氮和非豆科生物固氮，詳見圖1。

圖1 生物固氮類型Fig. 1 Types of biological N2 fixation

2 稻田生物固氮定量方法優(yōu)缺點(diǎn)

生物固氮的定量方法分為直接定量法和間接定量法。直接定量法為15N2氣體飼喂法。間接定量法有總氮差異法、15N 自然豐度法、15N 同位素稀釋法和乙炔還原法。

15N2氣體飼喂法是測(cè)定生物固氮的最直接方法。該方法向固氮系統(tǒng)中充入15N 標(biāo)記的氮?dú)?，通過(guò)測(cè)定系統(tǒng)中氮總量和15N 豐度，來(lái)計(jì)算固氮量。該方法直接、準(zhǔn)確、技術(shù)要求高、試驗(yàn)成本大。卑其成、謝祖彬等發(fā)明了田間原位智能氣密植物生長(zhǎng)控制技術(shù)（授權(quán)專利號(hào)ZL200910232184.3），并成功用于生物固氮研究[9]。該系統(tǒng)能自動(dòng)控制系統(tǒng)內(nèi)溫度和CO2濃度，并且有很好密封性（圖2）。

圖2 田間原位氣密植物生長(zhǎng)控制系統(tǒng)Fig. 2 In-situ field air-proof plant growth system

總氮差異法是計(jì)算一個(gè)系統(tǒng)試驗(yàn)前后總氮的差異來(lái)定量該系統(tǒng)在一定時(shí)間內(nèi)生物固定的氮量。該方法原理簡(jiǎn)單，只要測(cè)出試驗(yàn)期間輸入、輸出該系統(tǒng)的各氮分量，多出的部分就是生物固氮的氮量?？蓪?shí)施起來(lái)非常困難。輸入有土壤氮、干濕沉降、通過(guò)灌溉水輸入量、通過(guò)地下水輸入量；輸出有氨揮發(fā)、硝化-反硝化、徑流、淋溶、土壤氮和植物帶走的氮。要準(zhǔn)確測(cè)出這些輸入、輸出氮分量非常困難。短時(shí)間內(nèi)利用該法定量生物固氮量幾乎不能實(shí)現(xiàn)。如果通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間試驗(yàn)，忽視干濕沉降，通過(guò)灌溉水輸入量、地下水輸入量、氨揮發(fā)、硝化-反硝化、徑流和淋溶的氮，可以粗略地估算出生物固定的氮。

15N 同位素自然豐度法：土壤氮素自然轉(zhuǎn)化過(guò)程中14N 優(yōu)先離開土壤系統(tǒng)而使得15N 在土壤中富集，造成土壤中的15N 豐度高于生物利用大氣氮固定氮的豐度[10]。也就是土壤中的15N 豐度與生物固定氮的15N 豐度不一樣。這個(gè)方法比較適用于沒(méi)有人為擾動(dòng)的自然生態(tài)系統(tǒng)中，如不施肥草地和林地。如果自然生態(tài)土壤系統(tǒng)中的15N 豐度高于大氣，那么就可以用來(lái)定量研究生物固氮。但在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，由于大量施用與大氣15N 豐度相似的氮肥，而使得農(nóng)田土壤15N 與大氣15N 豐度相似，使得該方法難以用于農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)。

15N 同位素稀釋法：15N 穩(wěn)定性同位素稀釋法是研究共生固氮主要方法。該方法利用15N 同位素標(biāo)記肥料對(duì)一個(gè)固氮植物和非固氮植物（參照植物）進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)測(cè)定植物、土壤15N 豐度和含量，來(lái)計(jì)算生物固定的氮量。該方法一般不考慮其他輸入和其他輸出。該方法需要參照植物與固氮植物有相似的根系分布、生長(zhǎng)特性、吸氮能力和吸氮喜好。而且由于該方法需要有不固氮的參照系，在不能找到不固氮參照系時(shí)無(wú)法使用。

乙炔還原法是通過(guò)測(cè)定乙炔還原酶活性的變化來(lái)表征稻田生物固氮能力的變化，主要用于生物固氮的定性和半定量研究。固氮酶能將N2還原成NH3，也能將乙炔還原成乙烯。該方法一般是將樣品采回來(lái)放在實(shí)驗(yàn)室條件下，往樣品中注入乙炔，混勻。通過(guò)測(cè)定兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)瓶中乙烯濃度的變化來(lái)計(jì)算乙炔還原量。然后通過(guò)乙炔還原量與固氮量的理論轉(zhuǎn)化系數(shù)來(lái)?yè)Q算成生物固氮量。乙炔還原量與固氮量間的理論轉(zhuǎn)換系數(shù)為3︰1，即3 mol 乙炔還原量=1 mol固氮量。但固氮菌中的固氮酶在還原乙炔過(guò)程中受環(huán)境條件影響，有很大的不確定性[11]。Spiff 和Odu[12]發(fā)現(xiàn)在磚紅壤（latosols）上只有0.56，而Rice和Paul[13]發(fā)現(xiàn)在滯水條件下達(dá)15。Nohrstedt[14]發(fā)現(xiàn)水分含量對(duì)轉(zhuǎn)化系數(shù)影響巨大：當(dāng)土壤水分飽和時(shí)達(dá)15.7，而當(dāng)土壤水分低于飽和水分的75%時(shí)只有2.6。Hardy等[15]給出了4.3 作為平均轉(zhuǎn)化系數(shù)。目前用乙炔還原法研究生物固氮量時(shí)通常采用3 作為轉(zhuǎn)化系數(shù)。相對(duì)于15N2氣體標(biāo)記法，乙炔還原法簡(jiǎn)單、便宜和靈敏。雖然乙炔還原量和固氮量間的轉(zhuǎn)化系數(shù)存在不確定性，但仍是研究生物固氮的常用方法。

3 稻田生物固氮量影響因素

研究表明稻田的淹水環(huán)境為光合固氮菌和異養(yǎng)固氮菌的生物固氮提供了合適的pH 和氧化還原狀況等條件[8]。土壤水分狀況、水稻品種、施肥和碳源均影響稻田的生物固氮[8,16-18]。土壤有機(jī)質(zhì)高的土壤有利于稻田固氮菌生長(zhǎng)，有機(jī)物的施用促進(jìn)土壤生物固氮[16-18]。稻草秋季還田的土壤乙炔還原酶活性僅為春季還田的30%；光照條件下纖維素還田土壤的固氮效率是黑暗條件下的3 倍[8]。大量抑制固氮酶（nitrogenase）活性，而少量施氮對(duì)固氮酶活性沒(méi)有影響[19-20]；Charyulu 等[18]報(bào)道少量氮肥促進(jìn)土壤固氮，而大量施用抑制固氮；而且與施肥方式和氮肥種類有關(guān)[21]。Wang 等[22]研究了東北黑土、江蘇下位砂姜土、江西紅壤和四川紫色土發(fā)育水稻土的土壤屬性與生物固氮量的關(guān)系。他們利用Spearman 相關(guān)技術(shù)分析表明生物固氮量與土壤pH，交換性Na、Mg，總Ca、總Mg 成正相關(guān)，與交換性Al3+、活性和無(wú)定形Al 氧化物成負(fù)相關(guān)。他們進(jìn)一步分析表明土壤pH 又與交換性Na、Mg，總Ca、總Mg 成顯著正相關(guān)，與交換性Al3+、活性和無(wú)定形Al 氧化物成顯著負(fù)相關(guān)。但生物固氮量與固氮菌數(shù)量（nifH基因拷貝數(shù)）沒(méi)有關(guān)系。進(jìn)一步在固氮菌OTU 水平（操作分類單元水平）分析表明生物固氮量與念珠藻量成顯著正相關(guān)。他們用隨機(jī)森林模型中的均方差增加百分法評(píng)估了土壤各屬性對(duì)生物固氮影響的相對(duì)重要性，結(jié)果表明Al 氧化物最重要，其他依次為活性Fe、活性Al、總Mg、交換性Mg、C/N、有效Cu、土壤有機(jī)質(zhì)、黏粒含量和陽(yáng)離子交換量。

4 稻田固氮微生物及活躍固氮微生物

我國(guó)從20 世紀(jì)70 年代末開始從水稻根系分離固氮微生物。丘元盛等[23]分離到2 種固氮菌為糞產(chǎn)堿菌和陰溝腸桿菌。譚志遠(yuǎn)等[24]從廣東和海南普通野生稻中分離到37 株內(nèi)生固氮菌，采用固氮酶nifH基因PCR 擴(kuò)增測(cè)序檢測(cè)技術(shù)，鑒定可能屬于克雷伯氏菌屬、泛菌屬、克雷伯氏肺炎桿菌、阿氏腸桿菌、陰溝腸桿菌、丙二酸檸檬酸桿菌、成團(tuán)泛菌。孫建光等[25]采用16S rDNA 序列分析技術(shù)，分析了北京、內(nèi)蒙古、河北、遼寧、山東、陜西、寧夏、廣東、新疆、福建、貴州、四川和黑龍江等13 個(gè)省市自治區(qū)67 個(gè)旱地土壤和3 個(gè)稻田土壤樣品中的固氮微生物資源，得到非共生固氮微生物資源181 份，其中有36%屬于類芽孢桿菌屬，29%屬于芽孢桿菌屬，11%屬于節(jié)桿菌屬。Islam Rashedul 等[26]采用無(wú)氮培養(yǎng)分離技術(shù)對(duì)韓國(guó)7 種不同施肥管理措施下的稻田固氮微生物進(jìn)行了分離，分離到165 份細(xì)菌，其中32 份具有固氮基因，分別為布克氏菌、鞘氨醇單胞菌、甲基桿菌、假單胞菌、新鞘氨醇桿菌、桿菌、類芽孢桿菌、腸桿菌、克雷白氏桿菌、分枝桿菌、玫瑰單胞菌、環(huán)絲菌、寡養(yǎng)單胞菌、葉桿菌、格里蒙菌。da Costa 等在巴西3 種不同施肥管理土壤上分離到190 份疑似固氮微生物，除了Islam Rsshedul等[26]在韓國(guó)土壤中發(fā)現(xiàn)的布克氏菌、鞘氨醇單胞菌、假單胞菌、桿菌、類芽孢桿菌、腸桿菌、克雷白氏桿菌、寡養(yǎng)單胞菌等固氮菌外，還有噬氫菌、固氮根瘤菌、蒼白桿菌、產(chǎn)堿桿菌、根瘤菌、不動(dòng)桿菌、葡萄球菌、泛菌、埃希氏菌、檸檬酸細(xì)菌、無(wú)色桿菌、土壤桿菌[27]。

活躍固氮微生物指的是發(fā)揮固氮作用的固氮微生物。稻田中均有固氮微生物，但稻田中的固氮微生物種類和固氮能力各不相同，它們受水稻土類型、性質(zhì)和管理措施影響。目前有一些關(guān)于稻田固氮微生物數(shù)量和種類的報(bào)道，但很少有關(guān)于活躍固氮微生物研究的報(bào)道。這與研究活躍固氮微生物難度較大有關(guān)，雖然穩(wěn)定性同位素核酸探針（DNA or RNA stable isotope probing）技術(shù)為研究活躍固氮微生物提供了途徑。由于DNA 或RNA 中C 的含量是N 的兩倍多，13C-SIP 技術(shù)從2000 年建立[28]以來(lái)已取得一些進(jìn)展[29-32]，但15N-DNA（RNA）-SIP 技術(shù)進(jìn)展緩慢。Ma 等[33]用 99 atom%15N2研究了 Mo 施用對(duì)稻田土壤活躍固氮微生物的影響，發(fā)現(xiàn)非異形藍(lán)細(xì)菌（non-heterocystous cyanobateria）細(xì)鞘絲藻屬（leptolyngbya）和微鞘藻屬（Microcoleus）是主要的活躍固氮微生物。Buckley 等[34]用99.8 atom%15N2室內(nèi)培養(yǎng)土壤的方法研究長(zhǎng)期休閑土壤的固氮微生物，但遺憾的是結(jié)果中沒(méi)有提供證據(jù)證明15N-DNA在密度梯度離心的那一層，也沒(méi)有提供DNA15N 豐度來(lái)證明哪些微生物確實(shí)發(fā)生了固氮作用。大量發(fā)表的13C-DNA（RNA）-SIP 文章也沒(méi)有提供DNA（RNA）13C 豐度[29-32]。原因是用穩(wěn)定性同位素比值質(zhì)譜儀和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定13C 豐度需要0.8～1.0 μg 的核酸，而一般土壤提取的DNA（RNA）只有10～200 ng，無(wú)法滿足測(cè)定需要[35-36]。而DNA（RNA）中 N 較 C 要少，這就需要更多的 DNA（RNA）。納米二次離子質(zhì)譜（Nanoscale secondary ion mass spectrometry-NanoSIMS）實(shí)現(xiàn)了成像與單細(xì)胞穩(wěn)定性同位素測(cè)定的有機(jī)結(jié)合[37-38]。Woebken 等[39]用NanoSIMS 技術(shù)和15N2標(biāo)記技術(shù)，測(cè)定了15N2標(biāo)記和非標(biāo)記單細(xì)胞藍(lán)細(xì)菌體內(nèi)15N 豐度，證明了美國(guó)Monterey 海灣Elkhorn Slough 河口微生物簇群中的藍(lán)細(xì)菌具有固氮能力。這些工作說(shuō)明NanoSIMS 技術(shù)可以滿足DNA 密度梯度離心后各層中極微量DNA15N 的測(cè)定，但能在多大程度上解決稻田活躍固氮微生物問(wèn)題還缺乏研究。

5 稻田生物固氮調(diào)控

增加稻田生物固氮量可以減少化學(xué)氮肥使用、減少環(huán)境污染、降低能源消耗和提高農(nóng)民收入，是長(zhǎng)期想實(shí)現(xiàn)而又沒(méi)有取得大的進(jìn)展。有研究表明施用有機(jī)物能促進(jìn)稻田生物固氮[16-18]。Ma等[33]發(fā)現(xiàn)在低有效鉬土壤上（下位砂姜土）施用鉬酸鈉（1 kg hm-2）74 天能使稻田生物固氮量由22.3 kg hm-2提高至 53.1 kg hm-2。Ma 等[40]的研究還表明種植雜交水稻較常規(guī)粳稻能提高生物固氮。Andreozzi 等[41]接種Herbaspirillum huttienseRCA24，Enterobacter asburiaeRCA23 和Staphylococcussp.377 發(fā)現(xiàn)Herbaspirillum huttienseRCA24 的表現(xiàn)最好，能提高生物固氮、增加葉綠素含量、提高氮含量和水稻幼苗干重。但稻田生物固氮的研究還很不夠，非常缺乏大田應(yīng)用研究。

6 稻田生物固氮未來(lái)研究方向

稻田生物固氮的現(xiàn)象早被發(fā)現(xiàn)，但由于研究的難度非常大，進(jìn)展一直不大。為實(shí)現(xiàn)糧食產(chǎn)量和生態(tài)協(xié)調(diào)發(fā)展，有必要加大稻田生物固氮研究。

（1）DNA 基因測(cè)序是目前研究稻田固氮微生物的常用方法，可以提供較多的信息，但DNA 測(cè)序基因序列在與現(xiàn)有微生物數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)時(shí)，往往出現(xiàn)很多無(wú)法匹配的情況。主要原因是目前固氮微生物基因數(shù)據(jù)庫(kù)中固氮微生物種類較少。而固氮微生物基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因數(shù)據(jù)來(lái)源于純菌的分離和全基因測(cè)序。因此在測(cè)序大量采用的時(shí)候，純菌的分離、培養(yǎng)和全基因測(cè)序需要進(jìn)一步加強(qiáng)。

（2）關(guān)于稻田生物固氮量和固氮微生物，目前只對(duì)少數(shù)幾種水稻土開展了研究。我國(guó)稻田類型眾多，成土母質(zhì)和環(huán)境條件各異，需要進(jìn)一步加強(qiáng)研究。

（3）研究發(fā)現(xiàn)秸稈還田、接種固氮微生物菌劑和在低有效鉬土壤上施鉬可以大幅度提高稻田生物固氮量，但均還處在研究初期階段，還需要繼續(xù)研究，尤其要加強(qiáng)田間實(shí)際應(yīng)用效果研究。

（4）稻田固氮微生物不僅具有固氮功能，為植物提供氮素，還能分泌激素等促生物質(zhì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，但目前高效固氮微生物菌劑的開發(fā)力度不大，需要加強(qiáng)，同時(shí)需要加強(qiáng)固氮微生物與植物的互作研究。

（5）固氮微生物存在氮抑制，即在有氮條件下，固氮微生物不固氮或減少固氮。如何通過(guò)基因工程的辦法解除氮抑制是需要加強(qiáng)研究的課題。