復層豬小腸黏膜下層可吸收膜的降解性能

吳唯伊，李博文，劉玉華，王新知

(北京大學口腔醫(yī)學院·口腔醫(yī)院，修復科 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心 口腔數(shù)字化醫(yī)療技術和材料國家工程實驗室 口腔數(shù)字醫(yī)學北京市重點實驗室， 北京 100081)

近年來，種植已成為修復牙齒缺失的重要治療手段，但對于因牙周疾病、牙體疾病、外傷等原因[1]造成骨缺損較多的患者，種植治療的風險增大。種植區(qū)域牙槽骨局部骨量不足常采用引導性骨組織再生技術(guided bone regeneration，GBR)實行骨增量。屏障膜作為影響GBR技術成功與否的關鍵材料，主要分為不可吸收膜和可吸收膜，其中可吸收膜中的膠原膜具有優(yōu)良的生物相容性，在臨床應用效果良好，因此已成為目前最常用的屏障膜材料之一。在眾多膠原膜產(chǎn)品中，臨床使用最廣泛的是瑞士Geistlich公司生產(chǎn)的Bio-Gide?可吸收生物膜(以下簡稱Bio-Gide膜)， 已有研究證實其使用效果[2-5]，但有學者發(fā)現(xiàn)，Bio-Gide膜的單一膠原成分可能會造成降解速度快的問題[4, 6-7]，在體內(nèi)維持特定形狀和強度的時間與缺損內(nèi)骨再生的時間不相匹配。

細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)為去細胞的生物網(wǎng)架材料，主要成分除膠原外還含有糖蛋白和糖胺聚糖等，近年來成為組織工程支架材料的熱點。其中，豬小腸黏膜下層膜(small intestinal submucosa，SIS)因來源廣泛而易于獲得，是最常用的ECM材料之一。SIS膜具有良好的三維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，對酶解作用的抗性增強。本課題組前期研究已證實SIS膜具有良好的多孔性結(jié)構(gòu)，能有效促進體內(nèi)骨再生進程[8]，但SIS膜是否能有效改善膠原膜的降解性能尚有待研究。為此，本實驗擬采用復層豬小腸黏膜下層膜(multilaminated SIS，mSIS)，對其降解性能進行研究，并與臨床應用最為廣泛的Bio-Gide膜進行比較，為其進一步應用于臨床提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 體外降解實驗

1.1.1主要材料與試劑 mSIS膜(北京大清生物技術股份有限公司)、Bio-Gide膜(瑞士Geistlich公司)、膠原酶Ⅰ(美國Sigma公司)、Tris-HCl緩沖液(合肥博美生物科技公司)、氯化鈣顆粒(CaCl2，國藥集團化學試劑有限公司)。

1.1.2主要實驗儀器 凍干機(SPEX 6770，美國SPEX)、-80 ℃冰箱(MDF-U73V，日本Sanyo)、精密電子天平(AL104-IC，瑞士Mettler-Toledo)、臺式恒溫振蕩器(培英2-1，蘇州培英實驗設備有限公司)。

1.1.3實驗方法 將mSIS膜和Bio-Gide膜裁剪為1 cm×2 cm大小，精密電子天平稱重，記錄起始重量，記為m0。將試樣放入離心管中，倒入降解液[含12.5 U/mL Ⅰ型膠原酶的Tris-HCl(50 mmol/L，pH 7.4，含10 mmol /L CaCl2)溶液]至浸沒試樣，置于恒溫振蕩器中震蕩，設置參數(shù)為37 ℃、80 r/min。在第0、1、3、5、10天時肉眼觀察膜材料在降解液中的形態(tài)，拍照記錄。分別于第1、2、3、4、5、7、10、12、14天時將試樣取出，蒸餾水漂洗3次，置于-80 ℃冰箱內(nèi)預冷1 h小時后，置于凍干機內(nèi)冷凍干燥3 h，取出稱重，記為mn(n為取出第n天)。每個試樣做3個平行重復，結(jié)果取平均值。根據(jù)如下公式計算第n天材料的降解率(pn)：pn=(m0-mn)/m0×100%。

1.2 皮下埋植實驗

1.2.1實驗動物 新西蘭大白兔9只，雄性，普通級，5～6月齡，2.5～3.5 kg，由北京大學口腔醫(yī)學院實驗動物中心管理并飼養(yǎng)。實驗動物的使用及其相關操作經(jīng)北京大學生物醫(yī)學倫理委員會實驗動物福利倫理分會批準(LA2016264)。

1.2.2主要材料與試劑 mSIS(北京大清生物技術股份有限公司)、Bio-Gide膜(瑞士Geistlich公司)、戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)、鹽酸利多卡因注射液(北京益民藥業(yè)有限公司)、青霉素鈉(80萬單位，華北制藥股份有限公司)、蘇木素染液(北京中杉金橋生物有限公司)、伊紅染液(北京中杉金橋生物有限公司)。

1.2.3主要實驗儀器 石蠟包埋機(EC350，德國Microm)、輪轉(zhuǎn)式組織切片機(HM200，德國Microm)、精密鼓風干燥箱(BPG-9040A，上海一恒科學儀器有限公司)、光學顯微鏡(CKX-41，日本OLYMPUS)。

1.2.4實驗方法 以9只新西蘭兔為研究對象，按術后觀察時間點隨機分為4周組、8周組和12周組，每組3只動物，在每只兔的背部皮下分別對稱設計6個埋植部位。手術當日對動物稱重后按劑量30 mg/kg給予2%(質(zhì)量分數(shù))的戊巴比妥鈉溶液耳緣靜脈注射至角膜反射消失。背部備皮，在脊部正中兩側(cè)用記號筆標記手術切口位置，左右各3個，每個切口相距至少5 cm。常規(guī)消毒鋪巾，切口區(qū)局部注射利多卡因浸潤麻醉，切開背部皮膚后鈍性分離皮下組織，在背部左側(cè)3個切口內(nèi)分別埋入1 cm×1 cm的mSIS膜，右側(cè)3個切口埋入相同大小的Bio-Gide膜(圖1)。皮下組織和皮膚分層縫合關閉傷口，記錄埋植材料的分布。術后3天肌肉注射80萬單位青霉素，以預防感染。分別于術后4周、8周和12周對3只實驗動物進行空氣栓塞處死，觀察材料植入部位有無紅腫、溢膿及膜材料的排出。分離皮下植入材料時觀察膜的完整程度及與周圍組織粘連程度等。將剩余膜材料和周圍軟組織一起取出，浸泡于10%中性甲醛溶液中24～48 h，常規(guī)脫水透明、石蠟包埋、切片，進行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，光學顯微鏡下觀察mSIS膜和Bio-Gide膜降解程度及周圍組織相容性。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS 23.0對相關實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗的統(tǒng)計方法進行分析。檢驗水平為α=0.05，統(tǒng)計單位為每個試樣，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 體外降解實驗

2.1.1降解形態(tài)觀察 降解開始時，mSIS膜和Bio-Gide膜均位于離心管中下部，保持直立狀態(tài)(圖2A、2a)。降解1天后，mSIS膜保持良好的直立狀態(tài)，空間維持能力良好(圖2B)，Bio-Gide膜基本保持直立，稍顯柔軟(圖2b)。降解3天后，mSIS膜開始趨于柔軟，但基本還能在降解液中保持直立(圖2C)，而Bio-Gide膜已發(fā)生蜷曲皺縮，可見有分層，不能維持空間形狀，肉眼觀形態(tài)較降解初期明顯縮小(圖2c)。降解5天后，mSIS膜呈卷曲狀態(tài)，但形態(tài)仍基本完整，肉眼觀未見明顯縮小破碎或分層現(xiàn)象(圖2D)，而Bio-Gide膜已破碎，呈碎塊狀沉入管底，僅有部分殘留(圖2d)。降解10天后，mSIS膜肉眼觀較降解初期明顯縮小，呈卷曲狀貼附于管壁或沉于管底(圖2E)，Bio-Gide膜已完全降解，降解液澄清(圖2e)。

2.1.2體外降解率 mSIS膜和Bio-Gide膜的體外降解不同時期剩余質(zhì)量的實驗數(shù)據(jù)見表1，從降解第3天起，mSIS膜的剩余質(zhì)量明顯大于Bio-Gide膜，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。計算體外降解不同時期降解率，并將降解率繪制成折線圖(圖3)。mSIS膜在第12天時降解率達到100%，表明降解完全，而Bio-Gide膜在第7天時即降解完全。由折線圖可知，在降解初期，二者的降解速率均較快，在隨后幾天中降解速率趨于平緩，最終達到完全降解。

2.2 皮下埋植實驗

2.2.1植入材料解剖學觀察 觀察期內(nèi)所有動物均成活，膜材料植入?yún)^(qū)域均無明顯炎癥反應，未見明顯紅腫、感染及膜材料排出。皮下埋植4周時，mSIS膜維持相對完整的形態(tài)，周圍包裹一層極薄的纖維包膜，與周圍組織易剝離，膜大小及厚度與植入時基本相同；Bio-Gide膜形態(tài)較為完整，與周圍組織有部分粘連，剝離時易出現(xiàn)分層，肉眼觀未見明顯降解。術后8周，mSIS膜形態(tài)完整，剝離時與周圍組織部分有粘連；Bio-Gide膜8周時肉眼觀明顯變薄，部分已出現(xiàn)破碎，形態(tài)不完整，幾乎無法與周圍組織分離。術后12周時部分mSIS膜已破碎，僅可見少量mSIS膜殘留，與周圍組織粘連緊密；Bio-Gide膜已肉眼不可見，基本消失。

2.2.2組織學染色觀察 皮下埋植4周時，mSIS膜結(jié)構(gòu)完整，膠原纖維連續(xù)，與周圍結(jié)締組織分界清楚，膜周圍存在少許炎癥細胞浸潤(圖4A)；Bio-Gide膜結(jié)構(gòu)也相對完整，未見明顯降解跡象，但部分區(qū)域膠原纖維與周圍組織有融合，周圍可見少量炎性細胞浸潤(圖4a)。術后8周時，mSIS膜結(jié)構(gòu)較為完整，部分區(qū)域與周圍結(jié)締組織融合，膜膠原纖維內(nèi)部開始長入成纖維細胞，內(nèi)部未見明顯炎性細胞浸潤(圖4B)；Bio-Gide膜僅可見部分殘留纖維與與周圍組織結(jié)合，已無完整膜的形態(tài)(圖4b)。皮下埋植12周時，鏡下仍可觀察到mSIS膜殘留纖維，但已基本與周圍結(jié)締組織融合，無連續(xù)的膠原纖維形態(tài)，難以辨別(圖4C)；Bio-Gide膜已在鏡下不可見，完全與周圍結(jié)締組織融合(圖4c)，二者結(jié)締組織內(nèi)均未見明顯炎癥細胞浸潤。因此，可以認為，mSIS膜皮下埋植在12周時降解完全，而Bio-Gide膜在埋植后8周已降解完全，mSIS膜降解時間較Bio-Gide膜延長。二者僅在埋植初期引發(fā)周圍組織一過性炎癥反應，隨著植入時間延長，炎癥狀態(tài)消失，表明生物相容性良好。

表1 降解不同時期mSIS膜和Bio-Gide膜剩余材料質(zhì)量

3 討論

GBR技術是基于通過使用屏障膜來遮擋骨缺損，以防止快速增殖的上皮或結(jié)締組織生長，從而促進骨或牙周組織未受干擾的再生。有研究表明，依缺損大小不同，屏障膜至少須維持6周以上的時間[9-10]，以便骨缺損內(nèi)新骨形成。在大尺寸的骨缺損中，有學者甚至推薦更長的時間(例如長達4～6個月)用于骨再生[11-12]。而屏障膜的快速降解會造成軟組織侵入骨缺損，從而影響新生骨形成的進程，因此，良好的屏障膜必須在上述新生骨形成期間維持穩(wěn)定的形狀來發(fā)揮其屏障功能。目前臨床中最常應用的可吸收屏障膜是膠原膜，回顧以往的研究，從實驗數(shù)據(jù)中可以看出膠原膜的降解周期并未達到一致，一般在2周到8個月不等[13-15]。

目前已經(jīng)開發(fā)了各種交聯(lián)技術,通過增加膠原分子之間的天然連接來減緩酶解作用的速度，在延長降解時間的同時可以提高膠原膜的機械性能。這些交聯(lián)技術包括物理方法(如紫外線照射)和化學交聯(lián)劑處理(如二亞胺、戊二醛等)[16-17]。但與此同時，交聯(lián)后的膠原膜可能會導致植入后產(chǎn)生細胞毒性和鈣化，也會不同程度的影響血管化進程，從而延緩新生骨的形成[18-19]。另外一項臨床試驗還觀察到，化學交聯(lián)過的膠原膜在植入后發(fā)生暴露的可能性更高[20]。

ECM支架與純膠原膜相比，除含有膠原成分外，還含有糖蛋白、糖胺聚糖等成分，與膠原組分共同構(gòu)成縱橫交錯的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，對于酶促降解作用有更好的抗性。對于ECM的降解機制，Valentin等[21]研究發(fā)現(xiàn)，ECM結(jié)構(gòu)完整性的喪失多是由于巨噬細胞和多形核白細胞衍生出的酶進行的酶解作用所引起。而大量研究表明，ECM支架的降解是實現(xiàn)ECM介導組織重建過程所必需的步驟[22-23]。其中血源性單核巨噬細胞在ECM早期體內(nèi)降解過程中起到必要的作用，可以通過包括血管生成在內(nèi)的機制促進損傷組織的構(gòu)建性重構(gòu)，在組織重建部位募集多能祖細胞，釋放抗微生物肽，激活免疫替代途徑[24-25]。

對于屏障膜降解性能，目前研究中采用的方法主要包括體內(nèi)降解和模擬體外降解。體內(nèi)降解即采用動物模型，將膜埋植入動物體內(nèi)，一定時間后取材觀察降解程度或干燥后對剩余材料稱重，計算降解部分重量。體內(nèi)埋植部位包括上顎黏膜或皮下，上顎黏膜埋植多采用犬作為實驗動物[7]，對上顎黏膜翻全厚瓣后將膜材料植入，其優(yōu)點是可以最大程度地模擬膜在口腔環(huán)境中的降解行為，但采用犬作為實驗模型，價格較為昂貴，飼養(yǎng)空間和條件限制較多，且上顎黏膜翻瓣技術敏感性高，操作相對復雜。而皮下埋植操作相對更為簡單，為學者們所廣泛使用[15, 26-27]。

由于體內(nèi)降解需借助動物模型實現(xiàn)，實驗周期相對較長，操作相對復雜，另有研究證實，體外降解與體內(nèi)降解速率之間存在良好的相關性[28]，因此，可以在體外配制降解液，模擬體內(nèi)降解過程。由于Bio-Gide膜和mSIS膜主要組成成分均為Ⅰ型膠原，因此可以采用Ⅰ型膠原酶[29-30]配制降解液，對mSIS膜和Bio-Gide膜進行體外模擬降解過程。

對于Bio-Gide膜的降解，已有學者對其進行過研究，如Kozlovsky等[31]在大鼠顱骨制造圓形骨缺損，采用單層或雙層Bio-Gide膜覆蓋，術后4周質(zhì)量喪失率約60%，9周時達80%。Owens等[7]在犬上顎黏膜埋植Bio-Gide膜，術后4周組織學染色觀察已有輕至中度降解，術后8周檢測已達到中至重度降解。上述研究結(jié)果與本實驗Bio-Gide膜的降解時間基本一致，皮下埋植8周左右降解完全。

本研究對mSIS膜的降解性能進行檢測，結(jié)果顯示其皮下埋植降解時間約為12周，與Gilbert等[32]采用14C標記SIS膜間接研究其降解性能的結(jié)果基本一致，術后1個月降解約60%，術后3個月SIS膜移植體已完全被替代。另外，有學者對SIS膜的降解產(chǎn)物進行研究，采用14C標記的SIS膜材料修復犬膀胱缺損，追蹤14C發(fā)現(xiàn)SIS膜的代謝產(chǎn)物進入了循環(huán)血液中并最終通過尿液排出了體外，證明SIS膜材料植入后在修補區(qū)幾乎可以被新合成的基質(zhì)完全替代，絕大部分的SIS膜被降解為小分子物質(zhì)排出體外[33]。

此外，對于復層SIS膜降解性能的研究，Mewaldt等[34]曾使用含膠原酶等模擬傷口環(huán)境的蛋白水溶液對不同層數(shù)SIS膜進行體外模擬降解，結(jié)果表明SIS膜的降解速率與層數(shù)成反比，說明對SIS膜進行多層疊加處理有助于減緩膠原酶對SIS膜的降解作用。

通過以上研究可知，與Bio-Gide膜相比，mSIS膜降解時間延長，空間維持能力更佳，且生物相容性良好，基本滿足GBR技術中對于屏障膜降解性能的要求。