苯并[a]芘對(duì)腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元和α-突觸核蛋白的影響及其機(jī)制

祁宇澤，權(quán)會(huì)會(huì)，徐衛(wèi)星，李清如，周 輝

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，北京 100191)

苯并[a]芘[benzo(a)pyrene，BaP]是多環(huán)芳烴中重要的組成部分，廣泛存在于空氣、食物、土壤和水中，是人們生產(chǎn)和生活環(huán)境中常見(jiàn)的化學(xué)污染物。環(huán)境中BaP可以通過(guò)呼吸道、消化道和皮膚等途徑進(jìn)入人體，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)實(shí)驗(yàn)證明BaP是確認(rèn)的致癌物，可以誘發(fā)肝癌、肺癌等惡性腫瘤。由于BaP具有高度脂溶性，其與代謝產(chǎn)物易穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織產(chǎn)生神經(jīng)毒性。流行病學(xué)研究顯示，BaP的職業(yè)暴露能夠?qū)е鹿と饲榫w異常、植物神經(jīng)紊亂和短時(shí)記憶損傷，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，BaP能夠?qū)е聞?dòng)物平衡能力、空間學(xué)習(xí)和記憶能力損失[1-2]，還會(huì)誘導(dǎo)腦內(nèi)神經(jīng)元變性和死亡，最終引起神經(jīng)退行性疾病樣綜合征[3]。

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見(jiàn)于中老年的神經(jīng)退行性疾病，僅次于阿爾茲海默病，在中老年神經(jīng)退行性疾病中排第二位。PD主要病理改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性死亡，以及在多巴胺能神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)路易小體(Lewy bodies)， 其主要成分是α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)。α-syn是位于4q1-22SNCA基因編碼的一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為19×103的小分子蛋白，由140個(gè)氨基酸構(gòu)成。正常的α-syn具有水溶性，對(duì)于維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能、調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)遞質(zhì)釋放、參與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)突觸前膜囊泡釋放具有重要作用[4]。在PD的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)了部分α-syn編碼基因的基因點(diǎn)突變和異常擴(kuò)增可以促使其異常折疊和聚集，形成不溶性的α-syn聚集體，參與形成路易小體。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥[5]、殺蟲(chóng)劑[6-7]、空氣污染物[8]和交通污染物[9]長(zhǎng)期暴露均有可能增加PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

環(huán)境中BaP的廣泛和長(zhǎng)期暴露能產(chǎn)生神經(jīng)毒性，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，PD的發(fā)病也被證實(shí)與空氣污染物、交通污染物等環(huán)境因素息息相關(guān)。但目前尚未見(jiàn)研究報(bào)道BaP暴露與PD發(fā)病之間是否存在關(guān)聯(lián)，因此，本研究以表達(dá)人源α-syn的轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對(duì)象，采用BaP亞慢性暴露的方法，探討B(tài)aP暴露是否會(huì)增加PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，是否會(huì)誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)功能障礙、黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元減少、中腦α-syn增加等PD典型癥狀及病理改變，并探討可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步揭示BaP的神經(jīng)毒性作用機(jī)制提供一定的依據(jù)和線索。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與處理

于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所購(gòu)買(mǎi)具有C57BL/C3H小鼠遺傳背景，轉(zhuǎn)入人源SNCA基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，可以過(guò)表達(dá)人源α-syn。繁殖和基因篩選后飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部屏障設(shè)施內(nèi)，屏障設(shè)施保持12 h/12 h晝夜循環(huán)，溫度保持在(23±1) ℃，濕度為48%±10%，小鼠自由攝食和飲水。8月齡小鼠隨機(jī)分為2組，即BaP染毒組和對(duì)照組，每組8只，BaP染毒劑量為1.0 mg/kg體質(zhì)量(溶劑為玉米油)， 對(duì)照組給予玉米油，每天同一時(shí)間腹腔注射1次，連續(xù)染毒60 d。麻醉后心臟灌流處死小鼠，取出腦組織，一半置于4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液中，4 ℃過(guò)夜固定后轉(zhuǎn)移至30%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蔗糖溶液，脫水后取黑質(zhì)部制作30 μm冰凍切片；一半分離出中腦組織，儲(chǔ)存在-80 ℃中。

1.2 動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)能力，將小鼠放置在轉(zhuǎn)棒式疲勞儀上，啟動(dòng)儀器后，轉(zhuǎn)棒開(kāi)始與小鼠相反方向轉(zhuǎn)動(dòng)，小鼠在轉(zhuǎn)棒上開(kāi)始做強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)，觀察其在轉(zhuǎn)棒上開(kāi)始運(yùn)動(dòng)至掉落時(shí)間，以評(píng)價(jià)動(dòng)物反應(yīng)、平衡、協(xié)調(diào)及運(yùn)動(dòng)能力。在染毒開(kāi)始30 d、染毒結(jié)束后和染毒結(jié)束繼續(xù)飼養(yǎng)30 d后進(jìn)行轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)，每只小鼠實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果取平均值。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡

取小鼠黑質(zhì)部冰凍切片，加入3%(體積分?jǐn)?shù))過(guò)氧化氫溶液室溫作用10 min，消耗內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶。加入封閉液室溫封閉1 h，多巴胺能神經(jīng)元特異性蛋白酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗體(1 ∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，對(duì)應(yīng)的生物素化二抗(1 ∶1 000稀釋)室溫孵育1 h；生物素-親和素-過(guò)氧化氫酶復(fù)合物溶液(avidin-biotin-peroxidase-complex，ABC)室溫作用1 h；二氨基聯(lián)苯胺顯色液(diaminobenzidine，DAB)顯色后脫水封片，使用Pannoramic SCAN Ⅱ拍照系統(tǒng)和Caseviewer軟件觀察、拍攝多巴胺能神經(jīng)元，用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4 免疫蛋白印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

取小鼠中腦組織，加入含有PMSF和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取中腦組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后調(diào)整蛋白上樣量為每樣20 μg，使用15%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的分離膠和4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上(孔徑0.45 μm)。5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉室溫封閉1 h，α-syn一抗(1 ∶2 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，對(duì)應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記二抗(1 ∶2 000稀釋)室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影成像后拍照，Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定mRNA表達(dá)變化

取小鼠中腦組織，加入Trizol溶液進(jìn)行中腦組織總RNA提取，按照試劑說(shuō)明書(shū)配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，按照25 ℃ 10 min、50 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min程序從RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)，使用SYBR Green染料，按照試劑說(shuō)明配置反應(yīng)體系并設(shè)定循環(huán)條件，循環(huán)條件為95 ℃ 5 min 1個(gè)循環(huán)預(yù)變性、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)退火延伸。以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算BaP組目標(biāo)基因相對(duì)于對(duì)照組的變化倍數(shù)。所有引物均由Primer 3.0設(shè)計(jì)，上海Invitrogen公司合成。實(shí)驗(yàn)所用目的基因引物序列如表1所示。

表1 目的基因引物序列

LC3-Ⅱ, microtubules associated protein 1 light chain 3-β;Hspa1a, heat shock protein family A member 1A;Hsc70, heat shock cognate protein 70;Hsp90, heat shock protein 90;DAT, dopamine transporter;Vmat2, vesicular monoamine transporter 2;Synphilin-1, alpha synuclein interacting protein;GAK, cyclin-G-associated kinase;Htr1a, 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 1A;Htr1d, 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 1D;Htr5b, 5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 5B;Adora2a, adenosine A2a receptor;Adra1b, adrenergic alpha 1B receptor;Drd1, dopamine receptor D1;Drd2, dopamine receptor D2;Gabra5, gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor alpha 5;Hrh3, histamine receptor H3;Lepr, leptin receptor.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Excel 2019整理實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，SPSS 20.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析，兩組間均數(shù)比較采用Student’st檢驗(yàn)，拒絕無(wú)效假設(shè)的顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 BaP暴露影響小鼠運(yùn)動(dòng)能力

理論上，隨著實(shí)驗(yàn)次數(shù)增加，小鼠會(huì)逐步適應(yīng)轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)動(dòng)并掌握一定的在轉(zhuǎn)輪上運(yùn)動(dòng)的技巧，落棒時(shí)間會(huì)相應(yīng)延長(zhǎng)。本研究對(duì)照組小鼠3次轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)中，落棒時(shí)間即逐漸上升(P>0.1)；而實(shí)驗(yàn)組小鼠第2個(gè)月落棒時(shí)間明顯低于第1個(gè)月，第3個(gè)月落棒時(shí)間有所增加，但仍明顯低于第1個(gè)月和對(duì)照組(P<0.05，圖1)，說(shuō)明在連續(xù)2個(gè)月染毒后，BaP暴露可以導(dǎo)致小鼠運(yùn)動(dòng)功能損傷。

2.2 BaP誘導(dǎo)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡

正常生理狀況下，實(shí)驗(yàn)所用α-syn轉(zhuǎn)基因小鼠自身中樞神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)為廣泛的α-syn聚集，但沒(méi)有黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡。對(duì)小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元特異性蛋白TH染色后發(fā)現(xiàn)，注射BaP后，小鼠多巴胺能神經(jīng)元明顯減少，下降到對(duì)照組的62%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)，說(shuō)明BaP可以誘導(dǎo)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡。

2.3 BaP誘導(dǎo)中腦α-syn聚集體表達(dá)增多

除多巴胺能神經(jīng)元減少外，免疫蛋白印跡結(jié)果表明，注射BaP后，小鼠中腦α-syn表達(dá)顯著增多，為對(duì)照組1.36倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)，提示BaP暴露促進(jìn)α-syn聚集體形成和增多。

2.4 BaP暴露影響神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因表達(dá)

BaP暴露影響神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA表達(dá)，變化倍數(shù)大于1表示表達(dá)上調(diào)，變化倍數(shù)小于1表示表達(dá)下調(diào)。由表2可見(jiàn)，相較于對(duì)照組，多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transporter，DAT)表達(dá)下調(diào)為24%(P<0.05)，囊泡單胺類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體(vesicular monoamine transporter 2，Vmat2)表達(dá)下調(diào)為12%(P<0.05)。

2.5 BaP暴露影響神經(jīng)遞質(zhì)受體功能

RT-PCR結(jié)果表明，BaP暴露導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)受體功能相關(guān)基因mRNA表達(dá)發(fā)生顯著下調(diào)，其中5-羥多巴受體5b[5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 5b，Htr5b]表達(dá)下調(diào)至對(duì)照組的20%(P<0.01)， 5-羥多巴受體1a[5-hydroxytryptamine (serotonin) receptor 1A，Htr1a]、γ-氨基丁酸受體5a(gamma-aminobutyric acid A receptor alpha 5，Gabra5)、組胺受體h3(histamine receptor H3，Hrh3)和瘦素受體(leptin receptor，Lepr)均下調(diào)至對(duì)照組的1/3以下(P<0.05，表2)。

2.6 BaP暴露影響α-syn降解和細(xì)胞自噬

表2顯示，BaP暴露后自噬相關(guān)基因Beclin1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-β(microtubules associated protein 1 light chain 3-β，LC3-Ⅱ)及熱休克蛋白相關(guān)基因熱休克同源蛋白70(heat shock cognate protein 70，Hsc70)、熱休克蛋白家族A成員1A(heat shock protein family A member 1A，Hspa1a)、熱休克蛋白90(heat shock protein 90，Hsp90)的mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著下調(diào)，其中Beclin1表達(dá)量下調(diào)為34%(P<0.05)，LC3-Ⅱ表達(dá)下調(diào)為43%(P<0.05)；熱休克蛋白基因Hsc70、Hspa1a和Hsp90的mRNA表達(dá)量分別下調(diào)至對(duì)照組的29%、22%和33%(P均<0.05)。

2.7 BaP暴露影響α-syn聚集體形成

α-syn聚集體相關(guān)基因主要包括α-syn相互作用蛋白(alpha synuclein interacting protein，Synphilin-1)、Septin4、細(xì)胞周期蛋白G相關(guān)激酶(cyclin-G-associated kinase，GAK)等，其中Synphilin-1會(huì)促進(jìn)α-syn的聚集，Septin4相關(guān)蛋白表達(dá)可以保護(hù)α-syn免于自身聚集，GAK參與調(diào)解α-syn的表達(dá)和毒性。由表2可見(jiàn)，BaP暴露后Synphilin-1mRNA表達(dá)上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)達(dá)3.52倍(P<0.05)；同時(shí)Septin4表達(dá)下調(diào)至對(duì)照組的18%(P<0.01)；而GAK表達(dá)與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 BaP暴露對(duì)基因表達(dá)的影響

Abbreviations as in Table 1.

3 討論

BaP及其代謝產(chǎn)物由于其脂溶性，易于通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織產(chǎn)生神經(jīng)毒性，研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大鼠尾靜脈單次注射BaP，1、6和24 h后可在海馬、大腦皮層和紋狀體中檢測(cè)到BaP[10]，進(jìn)入腦內(nèi)的BaP可直接與芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AHR)結(jié)合，使AHR和其他伴侶蛋白(如Hsp90)分離，并與芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)結(jié)合，形成BaP-AHR-ARNT復(fù)合物，之后與位于啟動(dòng)子區(qū)域的外源性物質(zhì)應(yīng)答原件相互作用，從而干擾多種腦內(nèi)蛋白的表達(dá)[11]，導(dǎo)致神經(jīng)毒性。本研究以能夠表達(dá)人源α-syn的轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對(duì)象，分析BaP暴露后，小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和中腦α-syn變化狀況，實(shí)驗(yàn)中觀察到小鼠黑質(zhì)出現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡和中腦α-syn表達(dá)增加等PD特征性病理表現(xiàn)，提示BaP暴露可能為PD發(fā)病的一個(gè)環(huán)境危險(xiǎn)因素。

自從Jayasekara等[12]首先發(fā)現(xiàn)了BaP暴露對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒性以來(lái)，越來(lái)越多的研究表明BaP暴露導(dǎo)致的神經(jīng)毒性主要影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞。腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)包括腎上腺素、去甲腎上腺素、5-羥色胺和多巴胺等，神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物對(duì)心血管、神經(jīng)和內(nèi)分泌等組織系統(tǒng)具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，并對(duì)睡眠、情感、情緒和應(yīng)激行為等精神狀況產(chǎn)生影響[13]。Stephanou等[14]通過(guò)向大鼠腹腔注射BaP進(jìn)行染毒后發(fā)現(xiàn)大鼠新紋狀體、下丘腦、中腦和大腦皮層等腦組織腦內(nèi)去甲腎上腺素、多巴胺及其代謝產(chǎn)物均出現(xiàn)不同程度下降；Bouayed等[15]研究發(fā)現(xiàn)BaP經(jīng)口低濃度暴露后影響神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)受體基因表達(dá)，包括5-羥色胺受體、腎上腺素受體等。本研究中，BaP暴露后，5-羥色胺、γ-氨基丁酸、組胺和瘦素等多種神經(jīng)遞質(zhì)受體mRNA表達(dá)下調(diào)，提示BaP通過(guò)影響神經(jīng)遞質(zhì)受體產(chǎn)生神經(jīng)毒性，與既往研究中BaP亞急性暴露改變神經(jīng)遞質(zhì)的結(jié)果相一致。

神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在傳遞神經(jīng)遞質(zhì)，參與神經(jīng)元之間的信息傳遞中發(fā)揮重要作用，根據(jù)其基本結(jié)構(gòu)和作用部位分為兩個(gè)超家族：質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體與囊泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，其中DAT是一種質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，突觸Vmat2是囊泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的重要成員之一。在正常多巴胺能神經(jīng)元末梢中，TH合成多巴胺后儲(chǔ)存于突觸囊泡，通過(guò)胞吐作用釋放至突觸間隙，部分通過(guò)DAT重?cái)z入胞質(zhì)，再經(jīng)由Vmat2轉(zhuǎn)運(yùn)至囊泡，避免多巴胺過(guò)氧化[16]，二者在PD的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)BaP暴露后DAT和Vmat2表達(dá)發(fā)生明顯下調(diào)，提示在BaP暴露后，多巴胺重?cái)z取受到抑制，造成多巴胺在突觸間隙的淤積，多巴胺的重分布和穩(wěn)態(tài)遭到破壞，一方面減少循環(huán)再利用的多巴胺，另一方面導(dǎo)致多巴胺酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)增強(qiáng)，活性氧增多，造成神經(jīng)元損傷和死亡。

α-syn的錯(cuò)誤折疊和聚集是PD的重要病理性變化之一，在過(guò)表達(dá)α-syn的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)了由α-syn聚集形成的路易小體樣病理變化和運(yùn)動(dòng)障礙的疾病特征[17]，在PD的發(fā)病和進(jìn)展中起到了突出作用。在正常生理狀態(tài)下，可溶性的α-syn通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)進(jìn)行降解，也可以在溶酶體內(nèi)通過(guò)細(xì)胞自噬途徑降解[18]。在外界毒素作用下，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和細(xì)胞自噬系統(tǒng)遭到破壞，α-syn無(wú)法通過(guò)正常降解途徑降解，促進(jìn)其形成不易溶解的聚集體。研究表明，α-syn聚集體可以抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的蛋白降解作用；另一方面，α-syn聚集體與細(xì)胞自噬受體具有高親和性，但無(wú)法通過(guò)自噬途徑降解，從而抑制細(xì)胞自噬功能，導(dǎo)致α-syn聚集體不斷積累，進(jìn)一步引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和線粒體損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[19]。本研究測(cè)定了蛋白降解和細(xì)胞自噬特征性標(biāo)記物Beclin1、LC3-Ⅱ及熱休克蛋白基因Hsc70、Hspa1a和Hsp90的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BaP暴露后，5種基因mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)。Beclin1和LC3-Ⅱ均為細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白，其表達(dá)量升高表明自噬被激活，自噬體增多[20]；正常情況下，熱休克蛋白可以促進(jìn)自噬作用，而α-syn聚集體可以被熱休克蛋白特異性識(shí)別并結(jié)合到溶酶體膜表面，抑制細(xì)胞自噬功能。本研究中，BaP作用后5種蛋白降解和細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)記物mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)，提示BaP有可能影響細(xì)胞自噬功能，抑制α-syn分解并促進(jìn)其形成聚集體，α-syn聚集體又進(jìn)一步抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)與細(xì)胞自噬系統(tǒng)功能，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，從而增加PD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，本研究觀察到小鼠在BaP暴露后出現(xiàn)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡和中腦α-syn表達(dá)增多的PD特征性病理表現(xiàn)，提示BaP暴露有可能增加PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，加快并加重其發(fā)病進(jìn)程。進(jìn)一步的mRNA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明，BaP暴露可能抑制神經(jīng)遞質(zhì)受體與神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能，阻礙α-syn降解和細(xì)胞自噬作用。本研究探討了BaP暴露導(dǎo)致腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元變性死亡和α-syn聚集體形成，從而增加PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的潛在毒性作用機(jī)制，為研究BaP在神經(jīng)疾病中的毒性作用提供了一定依據(jù)。