慢性原發(fā)免疫性血小板減少癥患者血小板microRNA差異表達的研究

余文俊 林建雄 張澤文

汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液腫瘤科，廣東汕頭 515400

microRNA 屬于一種非編碼小RNA，約為20 ～25 個核苷酸大小，具有高度保守性。通過核酸互補序列，miRNA 可對特定的目標mRNA 進行識別，對其翻譯作用進行抑制，并促進其降解，進而使蛋白質(zhì)的合成得以抑制，起到對基因表達進行調(diào)控的作用[1]。在多種生物學(xué)過程中均有miRNA 的功能參與，且有相關(guān)研究表明，在疾病的治療情況、誘發(fā)以及疾病發(fā)展中，某些特定miRNA 均有參與，且其表達譜可用作疾病預(yù)后以及診斷期間的指標[2]。慢性原發(fā)免疫性血小板減少癥（ITP）是由于機體生成針對血小板自身抗原的抗體而誘發(fā)的出血性免疫性疾病，疾病會致使血小板被破壞，且血小板的生成過程也受到影響，進而導(dǎo)致血小板含量降低[3]。目前，臨床尚未發(fā)現(xiàn)該疾病的主要發(fā)病機制，但有相關(guān)研究提示[4]，該疾病患者的基因組DNA 低甲基化且基因譜表達異常。故本研究特選取2018 年6 月30 日～2019 年9 月25 日在我院接受治療的慢性原發(fā)免疫性血小板減少癥患者20 例的臨床資料進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選 取2018 年6 月30 日～2019 年9 月25 日在我院接受治療的ITP 患者20 例作為臨床研究對象進行回顧性分析，并以此為實驗組，再選取20 例健康群體為對照組。實驗組中女10 例，男10 例，年齡25 ～55 歲，平均（42.0±3.4）歲。血小板計數(shù)（3.0 ～50）×109/L，平均血小板計數(shù)為（25.76±3.56）×109/L。對照組中男10 例，女10例。年齡24 ～54 歲，平均（38.8±3.6）歲。血小板計數(shù)（170 ～345）×109/L，平均血小板計數(shù)為（276.43±31.99）×109/L。

納入標準[5]：（1）知情同意書經(jīng)患者及其家屬簽署，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意；（2）成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國專家共識（2016 年版）相符，即血小板補體C3 增多、血小板膜表面相關(guān)抗體增多、血小板生存時間縮短、切脾治療有效或激素治療有效，骨髓檢查存在有巨核細胞成熟障礙，且骨髓中巨核細胞數(shù)不減少，脾臟輕微增大或不增大，多次化驗檢查血小板計數(shù)減少；（3）以多部位與黏膜內(nèi)臟出血、皮膚瘀點或瘀斑為主要臨床表現(xiàn)。

排除標準：（1）明確病因的血小板減少癥；（2）精神病患者；（3）合并有糖尿病、腎、肝、心等嚴重原發(fā)??；（4）哺乳期或妊娠期婦女。

1.2 方法

1.2.1 分離microRNA 從肘靜脈抽取5mL 外周血加入至含有EDTA-K2抗凝劑的試管中，通過室溫條件下通過梯度離心法制成富血小板血漿（PRP），按Invitrogen 公司Trizol 總RNA 分離試劑盒說明書進行，進行RNA 提取。后對RNA 濃度及純度應(yīng)用由Nanodrop 科技公司生產(chǎn)的ND- 1000Nanodrop 分光光度計進行測定，并對RNA 完整性應(yīng)用凝膠電泳進行驗證。分離miRNA，按照 miRNeasy mini Kit（QIAGEN） 試劑盒的說明書進行操作。

1.2.2 microRNA 掃描、芯片雜交以及標記 標記microRNA 按照miRCURYTMHy3TM/Hy5TM標記試劑盒的說明書進行操作，雜交microRNA 的樣本為Hy3TM標記樣本，按照miRCURYTMLNA Array（v.16.0） 試劑盒標記試劑盒的說明書進行操作，兩種試劑盒是由丹麥Exiqon 公司提供。對microRNA信號強度分析掃描應(yīng)用由CA Foster City Axon Instruments 生產(chǎn)的Axon GenePix 4000B miRNA 芯片掃描儀。

1.2.3 處理以及分析芯片數(shù)據(jù) 將中位數(shù)標準化處理應(yīng)用至對 microRNA 數(shù)據(jù)中，信號強度超過50，對兩個樣品間雜交信號強度校正后的比值進行統(tǒng)計學(xué)處理，比值低于0.5 以及比值高于2 為有統(tǒng)計學(xué)差異。如存在統(tǒng)計學(xué)差異，則應(yīng)用MEV 軟件對表達差異的 microRNA 行分層聚類分析。

1.3 觀察指標

在具有統(tǒng)計學(xué)差異的microRNA 數(shù)據(jù)中將目的microRNA 選取處，實時對hsa-miR-181a、hsa-miR-148a 以 及hsa-miR-31 進 行RT-PCR，內(nèi)參物為U6，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件： 16℃30min， 42℃40min，85 ℃ 5min。實 時PCR 反 應(yīng) 條 件： 95 ℃10min，95℃ 10s，60℃ 1min，循環(huán)40 次。數(shù)據(jù)分析通過 2-△△Ct均數(shù)分析法進行[6]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

運用GenePix Pro6.0 軟件提取保存的數(shù)據(jù)并導(dǎo)入Excel，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，篩選慢性ITP 患者和健康對照者血小板差異表達的microRNA。

2 結(jié)果

2.1 提取的microRNA質(zhì)量分析

對兩組所有受檢者的血小板樣品進行microRNA 檢測分析，將microRNA 以及總RNA 提取后進行電泳。說明兩組混合樣本中總RNA 有清晰的28S 以及18S 條帶顯現(xiàn)。且A260nm/A280nm比值以及樣品質(zhì)量均符合要求。見圖1。

圖1 提取的microRNA 及總RNA 電脈結(jié)果

2.2 兩組受檢者中microRNA的表達

兩組受檢者之間篩選出161 個microRNA 有差異表達，其中顯著下調(diào)的表達為79 個，顯著上調(diào)的表達為82 個。分層聚類分析顯示，兩組受檢者的miRNA 表達譜差異顯著，說明實驗組中有特異性microRNA 表達譜存在。見圖2。

圖2 miRNA 表達譜差異，下調(diào)以綠色表示，上調(diào)以紅色表示

2.3 驗證目的microRNA RT-PCR

經(jīng)實時定量PCR 顯示，實驗組血小板中hsa-miR-181a 以及hsa-miR-148a 表達減弱，hsa- miR-31表達增強，結(jié)果符合芯片檢測結(jié)果。見圖3。

3 討論

圖3 microRNA RT-PCR 驗證結(jié)果，A、B、C 分別代表hsa- miR-31、hsa-miR-148a、hsa-miR-181a

miRCURYTMLNA Array （v.16.0）（丹麥Exiqon公司生產(chǎn)）中的探針有1891 個，包括了小鼠、大鼠、人類以及之相關(guān)所有病毒的m i c r o R N A，芯片選用miRCURYTM探針的技術(shù)基礎(chǔ)為LNA，在檢測microRNA 表達譜過程中具有較強的敏感性以及特異性[3，7]。本研究對兩組受檢者血小板混合標本中的microRNA 表達譜通過該芯片進行比較分析，以探討慢性原發(fā)免疫性血小板減少癥患者中microRNA 中表達是否有特異情況[8]。

本研究表明，兩組混合樣本中總RNA 有清晰的28S 以及18S 條帶顯現(xiàn)。且A260nm/A280nm 比值以及樣品質(zhì)量均符合要求。兩組受檢者之間篩選出161 個microRNA 有差異表達，其中顯著下調(diào)的表達為79 個，顯著上調(diào)的表達為82 個。分層聚類分析顯示，兩組受檢者的 miRNA 表達譜差異顯著，說明實驗組中有特異性microRNA 表達譜存在。經(jīng)實時定量PCR 表示，實驗組血小板中hsa-miR-181a 以及hsa-miR-148a 表達減弱，hsa- miR-31表達增強，結(jié)果符合芯片檢測結(jié)果。結(jié)合研究結(jié)果進行分析，ITP 屬于自身免疫性疾病，疾病特征即為具有器官特異性，故該疾病患者多伴有不同類型的免疫異常。目前，臨床對該疾病的發(fā)病機制尚不明確，多認為是一個多步驟的過程而誘發(fā)疾病，除了發(fā)育異常的巨核細胞、T 細胞活化以及自身反應(yīng)性B 細胞分泌抗血小板抗體以外，補體、自然殺傷細胞、抗原呈遞細胞等其他免疫元素的異常、巨核細胞成熟障礙、調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）功能異常和數(shù)量下降、細胞毒T 細胞介導(dǎo)的血小板裂解以及T 細胞向 Th1/Tc1 極化偏移均參與了疾病的發(fā)生[9-11]。并有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[12]，該疾病患者存在基因組 DNA低甲基化以及擾素調(diào)控基因等表達異常，說明該疾病患者多伴有基因表達調(diào)控異常。

microRNA 的功能與腫瘤發(fā)生、器官形成以及細胞分化密切相關(guān)，且隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)，其還影響著機體的免疫機制。對獲得性免疫反應(yīng)、天然免疫反應(yīng)以及免疫細胞的分化均有調(diào)節(jié)作用。在本研究中，對參與機體重要免疫調(diào)節(jié)過程以及參與疾病發(fā)展的microRNA 通過高通量芯片技術(shù)進行篩選，發(fā)現(xiàn)該疾病患者有諸多microRNA 存在異常表達。如T 細胞以及B 細胞的分化過程有microRNA-181a 參與，并在T 細胞成熟、發(fā)育時期通過 TCR 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將多種磷酸酶的表達程度降低，使T 細胞敏感程度得以調(diào)節(jié)。結(jié)合本研究結(jié)果，該疾病患者中microRNA-181a 表達下調(diào)，提示了在免疫細胞異常過程中有參與。而患者的CD4+T 淋巴細胞克隆變多，對T 細胞凋亡有抵抗作用，進而使免疫反應(yīng)得以維持。而microRNA-146a 對 TCR 的激活氣道誘導(dǎo)作用，對T 細胞有一定的保護作用，使其避免被激活而導(dǎo)致凋亡發(fā)生[13]。結(jié)合本研究結(jié)果，該疾病患者中microRNA-146a 表達上調(diào)，提示了在T 細胞異常凋亡過程中有參與。microRNA-21 在獲得性免疫過程中有參與，其水平上調(diào)對T 細胞凋亡有抑制作用。相關(guān)研究表明，microRNA-21 在牛皮癬、多發(fā)性硬化、SLE 等多種自身免疫性疾病中表達過高。microRNA-21 通過對DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶1 靶向抑制，致使CD4+T 細胞基因組甲基化降低。而實驗組患者有 DNA 低甲基化呈現(xiàn)，這可能與microRNA-21 的參與有關(guān)。

經(jīng)兩組受檢者的microRNA 表達情況對比發(fā)現(xiàn)，實驗組中有較多microRNA 異常表達，且與其他自身免疫性疾病中表達情況一致，如microRNA-29、microRNA-125b、microRNA-513a-5p、microRNA-146a、microRNA-181a、microRNA-15a、microRNA-21 等，提示此類microRNA 可能作為疾病發(fā)作的重要影響因子，對該疾病的誘發(fā)有直接影響作用。但目前國內(nèi)外對該項研究仍較少，需通過進一步深入探究才能得出更有效的結(jié)論。

綜上所述，microRNA 的異常表達可能對慢性原發(fā)免疫性血小板減少癥的發(fā)病機制有關(guān)，可對其深入研究，進一步分析在該疾病患者中不同個體間的microRNA 的表達差異，以探討其是否可作為該疾病的治療靶點或診斷的生物學(xué)標志。