不同清洗方式對(duì)三七主根重金屬及藥效成分含量影響

孫兆帥，楊 野，田夢媛，代春艷，石 玥，汪 瑞，官會(huì)林*

(1.云南師范大學(xué)，云南省農(nóng)村能源工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

【研究意義】三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]是五加科人參屬植物，主要種植于云南和廣西[1]，三七的干燥根和根莖含多種豐富的化學(xué)成分，如皂苷、揮發(fā)油、三七素、氨基酸、甾醇類等，其中皂苷是最主要藥效成分，目前已從其不同部位分離出60多種單體皂苷[2]。三七對(duì)心、腦血管疾病有較好的療效[3]，在國內(nèi)外擁有極高的聲譽(yù)，是中國出口的大宗藥材之一，近年來其出口量呈快速增長的趨勢[4]。然而，重金屬超標(biāo)現(xiàn)象在三七藥材中偶有發(fā)生，讓消費(fèi)者對(duì)三七的安全性產(chǎn)生了質(zhì)疑[5]。有研究表明，根表面粘土中的重金屬是三七重金屬的主要來源[6]。因此，洗凈三七根表泥土，就能極大限度地降低三七中重金屬含量。【前人研究進(jìn)展】三七傳統(tǒng)的加工方式為將鮮三七根表泥土抖落，分成不同部位曬干，再用銼刀把表面泥土打磨干凈。該方式較為費(fèi)力，且銼刀附著的泥土雜物容易在打磨過程中再次進(jìn)入三七中，從而存在重金屬超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)[7]。趙剛等[9]超聲提取蔬菜中的重金屬；曾清如等[10]采用不同濃度酸去除煙草、牧草等植物中的重金屬。隨著人們對(duì)重金屬安全意識(shí)的增加，有人使用清水浸泡和流水清洗來清除三七根表泥土，這2種方法可有效清洗三七，但容易使三七中皂苷類成分流失[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在其他藥材或其他農(nóng)產(chǎn)品中，發(fā)現(xiàn)超聲波清洗樣品，調(diào)整清洗溶液pH值、螯合劑濃度等，可以有效清除重金屬。然而，這些清洗方式是否適用于三七清洗仍未知?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以打磨處理三七主根為對(duì)照組，采用不同超聲時(shí)間、不同pH清洗液以及不同濃度乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)清洗三七，測定其鎘(Cd)、砷(As)、銅(Cu)、鉛(Pb)含量以及各皂苷含量，探索減少三七重金屬含量最大限度，最低限度減少皂苷損失的清洗條件，為三七的清洗方式提供參考，以促進(jìn)三七藥材的出口。

1 材料與方法

1.1 供試材料

三七主根樣品于2017年11月購自云南文山三七市場。

1.2 測試儀器和標(biāo)樣

高效液相色譜儀(HPLC-1260 infinity ，Agilent，美國)，原子吸收光譜儀(Agilent 240 Duo AAS Agilent，美國)，原子熒光光譜儀(AFS-F69B5，湖北匯瑞通光電科技有限公司)。Pb、Cd、Cu、As標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL，國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院)，對(duì)照品R1(CAS：80418-24-2，純度： HPLC≥98 %)、Rg1(CAS：22427-39-0，純度：HPLC≥98 %)、 Re(CAS：52286-59-6，純度：HPLC≥98 %)、Rb1(CAS：41753-43-9，純度：HPLC≥98 %)和Rd(CAS：52705-93-8，純度：HPLC≥98 %)均購自四川省維克奇生物科技有限公司，乙腈為色譜純，其他試劑均為優(yōu)級(jí)純。

1.3 處理方法

1.3.1 不同時(shí)間超聲清洗三七主根 將7組鮮三七主根依次超聲清洗0、1、2、4、6、8、10 min；超聲完成后，依次將每組三七用玻璃棒攪拌10、9、8、6、4、2、0 min，再流水沖洗3 min，干燥后打粉，每組處理重復(fù)3次。

1.3.2 不同pH值水溶液清洗三七主根 分別使用pH值為2.00、4.00、6.00、7.00、8.00、10.00、12.00的水溶液清洗鮮三七主根6 min，干燥后打粉，每組處理重復(fù)3次。

1.3.3 不同濃度EDTA-2Na溶液清洗三七主根 分別使用濃度為0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mol/L的EDTA-2Na溶液清洗鮮三七主根6 min，干燥后打粉，每組處理重復(fù)3次。

1.3.4 打磨處理三七主根 以打磨處理三七主根為對(duì)照，即選取質(zhì)量合適的三七主根，使用銼刀進(jìn)行打磨，搓掉表皮及泥土雜物后干燥打粉，重復(fù)3次。

1.4 重金屬含量測定

根據(jù)GB 5009.12-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉛的測定》、GB 5009.15-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鎘的測定》、GB 5009.11-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無機(jī)砷的測定》和GB 5009.13-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中銅的測定》的測定方法，對(duì)三七樣品中Pb、Cd、As和Cu含量進(jìn)行測定。Pb、Cd和Cu含量測定采用原子吸收光譜儀進(jìn)行測定，As含量測定采用原子熒光光譜儀進(jìn)行測定。

1.5 藥效成分的測定

1.5.1 供試品溶液的制備 精密稱取三七粉0.2 g，置于10 mL離心管中，加入甲醇5 mL，稱定質(zhì)量，搖勻，超聲30 min，繼續(xù)加甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，于3000 r/min離心5 min，再由0.45 μm微孔濾膜濾過可以得到供試品溶液，待測。

1.5.2 色譜條件 HPLC條件為Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色譜柱(美國Thermo Scientific公司，250 mm×4.6 mm，5μm)。流動(dòng)相：水(A)-乙睛(B)。線性梯度洗脫：(0 ～20 min，20 %B；20～45 min，20 %～46 %B；45 ～55 min： 46 % ～55 %B；55～60 min：55 %B)。檢測波長：203 nm。流速：1.0 mL/min。進(jìn)樣量：10 μl。

1.5.3 方法學(xué)考察 精密量取對(duì)照品溶液 3、5、8、10、13、15 μl進(jìn)行測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得三七皂苷 R1和人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd回歸方程分別為y=3107088x+39382(R2=0.9996)，y=3710214x+59857(R2=0.9994)，y=2786843x+47939(R2=0.9994)，y=2344051x+ 51125(R2=0.9992)，y=2728930x+50515(R2=0.9992)。日內(nèi)和日間精密度RSD均<5.0 %，供試樣品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，樣品加樣回收率97 %～102 %,表明建立的含量測定方法可靠。

表1 不同超聲時(shí)間清洗三七主根對(duì)其重金屬含量及藥效成分影響

注：同列后不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters after the same column indicated significant difference (P<0.05), the same as below.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超聲時(shí)間清洗三七主根對(duì)其重金屬含量和藥效成分影響

由表1顯示，對(duì)照As、Cu、Pb含量均低于安全限量標(biāo)準(zhǔn)，Cd含量超標(biāo)。不同超聲時(shí)間清洗三七主根As、Cu、Cd、Pb含量都低于安全限量標(biāo)準(zhǔn)。與對(duì)照相比，超聲0、1 min條件下Cu含量分別為(4.26±0.06)、(4.11±0.09)mg/kg，顯著高于對(duì)照8.3 %、4.6 %；超聲0、1、2 min條件下Pb含量分別為(4.19±0.14)、(3.85±0.28)、(3.55±0.07)mg/kg，顯著高于對(duì)照37.4 %、26.2 %、16.2 %；其余超聲條件下As、Cu、Cd、Pb含量都顯著低于對(duì)照。隨超聲清洗時(shí)間增加，各超聲條件下重金屬的平均去除率呈上升趨勢，但在超聲時(shí)間大于6 min后上升趨勢不顯著，在超聲10 min條件下達(dá)到最高，為62.8±1.51 %。超聲8、10 min時(shí)，總皂苷含量分別為(6.61±0.13)%、(6.49±0.20)%，低于對(duì)照0.2 %和2.2 %，無顯著性差異；其他超聲條件下總皂苷含量均顯著高于對(duì)照?？傇碥論p失率表現(xiàn)為隨超聲時(shí)間增加不斷升高，超聲0 min時(shí)總皂苷損失率最低，為-21.5 %±1.45 %。

表2 不同pH值水溶液清洗三七主根對(duì)其重金屬含量及藥效成分影響

表3 不同濃度EDTA-2Na溶液清洗三七主根對(duì)其重金屬含量及藥效成分影響

2.2 不同pH值水溶液清洗三七主根對(duì)其重金屬含量和藥效成分影響

由表2顯示，不同pH值條件下清洗三七主根As、Cu、Pb含量都低于安全限量標(biāo)準(zhǔn)，Cd含量在pH值為8、10、12時(shí)超過安全限量標(biāo)準(zhǔn)，分別為(0.41±0.04)、(0.45±0.02)、(0.49±0.03)mg/kg。與對(duì)照相比，所有處理As、Cu、Cd、Pb含量都顯著低于對(duì)照。隨著清洗液pH的升高，各處理重金屬的平均去除率呈下降趨勢，pH值為2～6和8～12時(shí)，平均去除率下降趨勢不顯著，在清洗液pH值為4時(shí)平均去除率最高，為57.2 %±0.79 %。清洗液pH值為10、12時(shí)，總皂苷含量分別為6.59 %±0.16 %、6.53 %±0.03 %，低于對(duì)照0.6 %、1.6 %，無顯著性差異，其他處理下總皂苷含量均高于對(duì)照，除pH值為8的處理皆差異顯著?？傇碥論p失率隨pH值增加先降低再升高，在pH值6時(shí)最低，為-23.7 %±2.39 %。

2.3 不同濃度EDTA-2Na溶液清洗三七主根對(duì)其重金屬含量和藥效成分影響

表3顯示，不同濃度EDTA-2Na溶液清洗三七主根As、Cu、Pb含量均低于安全限量標(biāo)準(zhǔn)，在EDTA-2Na濃度為0、0.005、0.01 mol/L條件下，Cd的含量超過安全限量標(biāo)準(zhǔn)，分別為(0.63±0.02)、(0.54±0.02)、(0.32±0.02)mg/kg。與對(duì)照相比，EDTA-2Na濃度為0 mol/L時(shí)，As、Cu、Pb含量分別為(0.63±0.02)、(3.95±0.07)、(3.09±0.06)mg/kg，高于對(duì)照4.1 %、0.4 %、1.2 %，均無顯著性差異。EDTA-2Na濃度為0.005 mol/L時(shí)，Cu含量為(3.95±0.06)mg/kg，高于對(duì)照0.4 %，差異不顯著。EDTA-2Na濃度為0.01、0.02 mol/L時(shí)，Cu含量分別為(3.86±0.03)、(3.85±0.03)mg/kg，低于對(duì)照1.8 %、2.1 %，均無顯著性差異。其他處理下As、Cd、Cu、Pb含量均低于對(duì)照，差異顯著。隨著EDTA-2Na濃度升高，重金屬的平均去除率呈上升趨勢，但EDTA-2Na濃度大于0.05 mol/L后上升趨勢不顯著，濃度達(dá)到0.2 mol/L時(shí)，重金屬去除率最高，為54.4 %±3.16 %。該處理下總皂苷含量均顯著高于對(duì)照。隨著EDTA-2Na濃度變化，總皂苷損失率并沒有顯著變化趨勢。

3 討 論

三七傳統(tǒng)干燥方式是將新鮮采挖的三七在曬場上攤開、修剪(將剪口、主根和筋條分開)直至干燥，或?qū)⑿藜艉蟮募艨诤椭鞲诳痉恐懈稍?。?duì)于干燥后的三七，通常采用打磨的方式去除表面附著的泥土。因而，三七產(chǎn)地加工中鮮見清洗操作環(huán)節(jié)，僅少數(shù)飲片廠可見。研究發(fā)現(xiàn)三七根表浮土是藥材中重金屬主要來源[6]，故通過清洗的方式去除根表浮土是有效控制重金屬含量的重要途徑之一。曾憲彩等[7]曾研究比較過流水與浸泡清洗對(duì)三七剪口重金屬清除和皂苷損失的影響。但三七清洗過程操作仍缺乏科學(xué)數(shù)據(jù)支撐。

通過對(duì)超聲波清洗三七主根實(shí)驗(yàn)考察，發(fā)現(xiàn)隨超聲波作用時(shí)間增加，清洗后三七主根As、Cu、Cd、Pb的平均去除率和總皂苷損失率均呈上升趨勢，但在6 min后4種重金屬元素去除率趨于穩(wěn)定。即一定范圍內(nèi)延長超聲清洗時(shí)間可降低三七主根重金屬含量，同時(shí)亦造成了皂苷的損失。邵玉芳等[11]研究表明超聲波對(duì)蔬菜中重金屬的提取率在一定時(shí)長內(nèi)隨超聲時(shí)間增加，亦驗(yàn)證了本研究結(jié)果。這是超聲波在液體介質(zhì)傳播中產(chǎn)生空化效應(yīng)，對(duì)清洗物表面進(jìn)行撞擊、剝離，從而隨超聲時(shí)間增加不斷加強(qiáng)對(duì)重金屬的去除效果直至最大值[12-14]。三七皂苷具有較好的水溶性，超聲作用會(huì)加劇皂苷水溶現(xiàn)象，從而增加皂苷的損失率。馬妮等[15]研究也表明三七皂苷的提取率隨超聲時(shí)間的增加而增加。因而，在保障三七藥材重金屬含量符合標(biāo)準(zhǔn)的條件下應(yīng)盡量降低超聲清洗時(shí)間以減少皂苷損失。

Jing Yuan[16]等研究發(fā)現(xiàn)用0 %、0.1 %、0.25 %、0.5 %、1 % 5種濃度鹽酸萃取油菜籽中重金屬，重金屬萃取效率隨鹽酸濃度升高而增加。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水溶液pH值不超過7時(shí)，清洗后三七重金屬含量均未超標(biāo)，且隨水溶液pH值增加，重金屬的平均去除率呈下降趨勢。這種現(xiàn)象是由于低pH環(huán)境有利于重金屬的遷移及釋放，高pH環(huán)境會(huì)提高重金屬的穩(wěn)定性[17-18]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在水溶液pH值6時(shí)，三七主根總皂苷損失率最小，即皂苷損失在弱酸酸環(huán)境中較少。這是由于皂苷水溶液呈弱酸性，在堿性條件下，皂苷上的OH-以陰離子-O-形式存在，無法與離子液體的陰離子產(chǎn)生氫鍵；而強(qiáng)酸條件下，糖鍵易發(fā)生斷裂，發(fā)生水解[19]。因此，綜合考慮重金屬的去除和皂苷的保留，以使用弱酸性清洗液清洗三七為宜。

螯合劑可使重金屬離子生成性質(zhì)完全不同的螯合物，主要應(yīng)用于重金屬元素的萃取[20]。如文陳兆慧等[21]采用吡咯烷二硫代氨基甲酸銨-二乙基二硫代氨基甲鈉-甲基異丁基甲酮(APDC-DDTC-MIBK)螯合萃取茜草，以準(zhǔn)確測定茜草中Pb的含量。雷鳴等[22]研究也表明在EDTA濃度為0～0.02 mol/L時(shí)，對(duì)土壤重金屬萃取率急速上升，而在0.05 mol/L處，萃取效率則基本達(dá)到平衡。使用不同濃度的EDTA-2Na清洗三七主根，隨EDTA-2Na濃度升高，重金屬的平均去除率呈上升趨勢，在EDTA-2Na濃度大于0.05 mol/L后趨于平緩，而總皂苷損失率則無明顯變化趨勢。即增加EDTA-2Na濃度可以在一定范圍內(nèi)減少三七的重金屬含量，且對(duì)皂苷含量無明顯影響。說明EDTA對(duì)重金屬的去除效果隨濃度增加有最大值，需要選取合適的濃度進(jìn)行清洗來節(jié)約成本，清洗三七主根的EDTA-2Na濃度以0.05 mol/L為宜。

4 結(jié) 論

確保三七藥材重金屬含量在允許標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定之下應(yīng)盡量降低超聲清洗時(shí)間以減少皂苷損失；使用弱酸性水清洗三七可以保證藥材重金屬不超標(biāo)并能最大限度保留皂苷成分；使用濃度0.05 mol/L EDTA-2Na溶液清洗三七主根能保證重金屬清洗效果并節(jié)約成本。