喀西茄在黃萎病病菌脅迫下的生理生化防衛(wèi)反應(yīng)

尹夢瑩，杜光輝，龔亞菊，黎志彬，鮑 銳，吳麗艷*

(1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，云南 昆明 650205；2. 云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650500)

【研究意義】茄子黃萎病(Verticillium Wilt) 是由大麗輪枝菌 (VerticilliumdahliaeKleb.)侵染引起的危害茄子生產(chǎn)的主要病害之一，是一種嚴(yán)重的土傳維管束病害[1]。自20世紀(jì)80年代中期以后，該病發(fā)病范圍自北向南不斷擴(kuò)大，一般年份發(fā)病率在40 %～50 %，嚴(yán)重年份發(fā)病率達(dá)70 %以上，導(dǎo)致茄子大幅度減產(chǎn)，甚至絕收[2]。目前，農(nóng)業(yè)防治為主，藥劑防治為輔的綜合防治措施由于諸多原因，均未能取得理想效果。【前人研究進(jìn)展】研究表明，茄子栽培品種缺乏抗性資源，但其近緣野生種中卻存在大量的抗性基因[3]。野生茄資源具有很強(qiáng)的抗性以面對復(fù)雜的自然環(huán)境，因此具有潛在的利用價(jià)值[4]。其中，茄子近緣野生種喀西茄(SolanumkhasianumC. B. Clarke)具有免疫或高抗黃萎病、褐紋病，根結(jié)線蟲、蘋果鉆心蟲等優(yōu)良性狀[5-8]，在茄子抗病蟲育種上受到廣泛關(guān)注。病原菌侵染植株后，寄主細(xì)胞或組織將發(fā)生一系列與抗病性相關(guān)的生理生化代謝反應(yīng)，這些反應(yīng)通常由生物活性酶所調(diào)控，因此生物活性酶的活性變化能在一定程度上反映寄主與病原菌的互作關(guān)系[9]。大量研究表明，過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)在黃萎病病菌侵染后發(fā)生了顯著變化[10]，且接種后POD和SOD活性抗病品種比感病品種高，而PAL活性則相對穩(wěn)定[11]。鄭陽霞等[12]認(rèn)為相對電導(dǎo)率、可溶性糖的相對滲出率和丙二醛(MDA)含量的降低以及CAT、POD的活性升高是嫁接茄子獲得抗病性的重要生理基礎(chǔ)。目前已有研究顯示，可溶性蛋白含量與抗病性呈正相關(guān)[13]。有關(guān)葉片光合參數(shù)的研究也表明，葉綠素含量與西瓜枯萎病[14]、黃瓜霜霉病[15]和甜瓜白粉病[16]等多種病害的抗性有關(guān)。綜上所述，病原菌侵染植株能使其體內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)、光合色素以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)發(fā)生與植物抗病性相關(guān)的變化，這些研究成果對于研究抗性機(jī)制和抗病育種具有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然，前人對茄子黃萎病進(jìn)行了一定的研究，但主要是圍繞抗病材料野茄托魯巴姆(S.torvum)展開，缺乏其他抗病材料的相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以栽培品種昆明紫長茄為對照，通過對大麗輪枝菌侵染野茄喀西茄前后的植物體內(nèi)保護(hù)酶、滲透性物質(zhì)、光合色素、MDA和相對電導(dǎo)率的變化規(guī)律分析，系統(tǒng)的揭示喀西茄對黃萎病防衛(wèi)反應(yīng)的生理生化機(jī)理，為茄子抗黃萎病的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試茄子資源 黃萎病高抗材料野生喀西茄(S.khasianumC. B. Clarke)由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所收集并保存，感病材料昆明紫長茄(S.melongenaL.)為云南當(dāng)?shù)刂髟郧炎悠贩N。

1.1.2 供試大麗輪枝菌菌株 強(qiáng)致病力黃萎病菌株QZ-S是由課題組從昆明地區(qū)一株染病茄子的根部分離純化得到[4]，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和保存。

1.2 接種與取樣

1.2.1 病原菌孢子懸浮液的制備 按照吳麗艷等[4]人的試驗(yàn)方法，將保存的黃萎病菌株QZ-S置于PDA平板上，在25 ℃暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15～20 d，再轉(zhuǎn)至查氏液體培養(yǎng)基中[17]，110 r/min的轉(zhuǎn)速下25 ℃振蕩培養(yǎng)5～7 d。將培養(yǎng)好的液體培養(yǎng)基用孔徑為25 μm的無菌雙層紗布過濾，將上述所得濾液在5500 r/min高速離心機(jī)下離心30 min，所得沉淀添加無菌水，應(yīng)用16 × 25血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子懸浮液濃度調(diào)整至1 × 107CFU/mL (CFU，Colony Forming Unit; CFU/mL 指每毫升樣品中含有的細(xì)菌群落總數(shù))備用。

1.2.2 人工接種及取樣 茄子種子滅菌后，在30 ℃的培養(yǎng)箱中萌發(fā)，隨后將萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)移到滅菌的土壤中，放置在25 ℃/15 ℃(白天/黑夜)的溫室中培養(yǎng)。當(dāng)長出2對真葉時(shí)，將茄子幼苗根浸泡在孢子懸浮液中30 min進(jìn)行人工接種。分別在接種0、7、14、21和28 d后采集大麗輪枝菌處理過的植物的葉片。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采集3～5株長勢一致植株的中間葉片混合為1個(gè)樣品，共設(shè)置3次重復(fù)。所有的樣品在液氮中迅速冷凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生理指標(biāo)測定及方法

對于活性酶的提取和分析，將葉片(0.1 g)在液氮中研磨，然后懸浮在含有10 mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)的0.9 mL溶液中。然后將勻漿在4 ℃下以2500轉(zhuǎn)/min離心1 min，收集上清液備用。其中：SOD的活性采用總超氧化物歧化酶測定試劑盒(A001-1)測定；POD的活性用過氧化物酶測定試劑盒(A084-3)測定；PAL采用肉桂酸比色法；CAT采用比色法。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法；葉綠素含量采用乙醇丙酮(1∶1)法；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法；可溶性糖含量采用植物可溶性糖含量檢測試劑盒(A145)測定。以上測定參照李合生等人[18]的方法。上述檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所(中國南京)，并使用DDS-306電導(dǎo)率儀(中國成都方舟公司)進(jìn)行相對電導(dǎo)率的測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用軟件Excel 2003和SPSS 17. 0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同茄子材料在黃萎病病菌侵染下的酶促保護(hù)系統(tǒng)的變化

從圖1～4可以看出，在黃萎病病菌侵染前，葉片保護(hù)酶SOD、POD、PAL和CAT的活性喀西茄均高于昆明紫長茄。在接種病菌后，葉片的SOD和PAL活性喀西茄始終高于昆明紫長茄?？ξ髑训腟OD活性在病菌接種后0～7 d迅速升高，7～14 d出現(xiàn)短暫的緩和期，而后又呈現(xiàn)上升趨勢。昆明紫長茄的SOD活性在病菌接種后0～21 d變化趨勢與喀西茄相同，但在21～28 d其活性下降?？ξ髑训腜OD活性在病菌接種后0～7 d升高至第1個(gè)小峰值，在7～14 d略有下降，隨后逐漸升高。昆明紫長茄的POD活性在病菌接種后0～28 d逐漸升高，且在21 d時(shí)其活性明顯超過喀西茄的。昆明紫長茄和喀西茄葉片PAL、CAT活性病菌接種后的變化趨勢相同，均在第7和21天出現(xiàn)2次波峰，但二者CAT活性侵染后均低于侵染前。

*表示不同材料之間的差異顯著水平P<0.05，下同*indicated the significant level of difference between materials at P< 0.05, the same as below圖1 不同茄子材料接種大麗輪枝菌后SOD酶活性的變化Fig.1 Changes of SOD activity in different eggplant materials after V. dahliae inoculation

圖2 不同茄子材料接種大麗輪枝菌后POD酶活性的變化Fig.2 Changes of POD activity in different eggplant materials after V. dahliae inoculation

2.2 不同茄子材料在黃萎病病菌侵染下的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

從圖5～6顯示，在病菌侵染前，葉片可溶性蛋白和可溶性糖的含量喀西茄均顯著高于昆明紫長茄。而病菌接種后，可溶性蛋白含量變化趨勢與昆明紫長茄相同，且其含量喀西茄始終高于昆明紫長茄。而在接種后0～28 d，昆明紫長茄葉片可溶性糖含量逐漸增高，并于接種后21 d時(shí)明顯超過喀西茄，至第28天，可溶性糖含量昆明紫長茄是喀西茄的2倍多。

2.3 不同茄子材料在黃萎病病菌侵染下的光合色素含量的變化

由圖7～9可見，黃萎病病菌接種前后，葉片光合色素葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量喀西茄始終高于昆明紫長茄。接種后0～21 d，光合色素葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量變化趨勢兩者一致，均逐漸降低；接種后21～28 d，其含量均升高。而接種后的昆明紫長茄光合色素含量相對穩(wěn)定，變化幅度不大。

圖3 不同茄子材料接種大麗輪枝菌后PAL酶活性的變化Fig.3 Changes of PAL activity in different eggplant materials after V. dahliae inoculation

圖4 不同茄子材料接種大麗輪枝菌后CAT酶活性的變化Fig.4 Changes of CAT activity in different eggplant materials after V. dahliae inoculation

圖5 不同茄子材料接種大麗輪枝菌后可溶性蛋白含量的變化Fig.5 Changes of soluble protein content in different eggplant materials after V. dahliae inoculation

圖6 不同茄子材料接種大麗輪枝菌后可溶性蛋白糖的變化Fig.6 Changes of soluble sugar content in different eggplant materials after V. dahliae inoculation

圖7 不同茄子材料接種大麗輪枝菌后葉綠素a含量的變化Fig.7 Changes of chlorophyll a content in different eggplant materials after V. dahliae inoculation

圖8 不同茄子材料接種大麗輪枝菌后葉綠素b含量的變化Fig.8 Changes of chlorophyll b content in different eggplant materials after V. dahliae inoculation

圖9 不同茄子材料接種大麗輪枝菌后總?cè)~綠素含量的變化Fig.9 Changes of content of total chlorophyll in different eggplant materials after V. dahliae inoculation

如圖10所示，葉片胡蘿卜素含量喀西茄始終高于昆明紫長茄?？ξ髑训念惡}卜素含量在病菌接種后0～7 d升高，7～14 d下降，14～28 d又逐漸升高。昆明紫長茄的類胡蘿卜素含量在病菌接種后0～21 d的變化趨勢與喀西茄相同，但在接種后21～28 d下降，且在第7和21天分別出現(xiàn)2次峰值。

2.4 不同茄子材料在黃萎病病菌侵染下相對電導(dǎo)率和MDA含量的變化

從圖11～12可以看出，在病菌接種前，葉片相對電導(dǎo)率喀西茄顯著高于昆明紫長茄；接種后，昆明紫長茄和喀西茄的相對電導(dǎo)率的變化趨勢相同，喀西茄在接種后0～14 d，相對電導(dǎo)率逐漸升高，在第14 d達(dá)到極值后下降。

同時(shí)，葉片的MDA含量在病菌接種前昆明紫長茄顯著高于喀西茄，而在病菌侵染后二者的變化趨勢相同，且昆明紫長茄始終高于喀西茄。昆明紫長茄和喀西茄葉片MDA含量在接種0～14 d時(shí)略有下降，隨后一直呈現(xiàn)上升趨勢，至接種21 d時(shí)達(dá)到峰值，而后逐漸下降。

圖10 不同茄子材料接種大麗輪枝菌后類胡蘿卜素含量的變化Fig.10 Changes of carotenoid content in different eggplant materials after V. dahliae inoculation

3 討 論

以往研究結(jié)果證實(shí)，病原菌的侵染會影響植株的正常生活，這與植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧有關(guān)。因此，植物體內(nèi)會發(fā)生一系列由生物活性酶調(diào)控的生理生化變化以清除活性氧。

不同的病害研究中，SOD的活性差異很大，莊炳昌等[19]用大豆病毒接種大豆發(fā)現(xiàn)SOD酶活性下降，與之相似，Buonaurio等[20]發(fā)現(xiàn)煙草接種馬鈴薯Y病毒后SOD酶活性也下降。而李海蓮等[11]研究發(fā)現(xiàn)，感、抗病茄子品種在接種黃萎病菌粗毒素后，SOD活性均隨著接種時(shí)間的延長而增加。本研究發(fā)現(xiàn)，黃萎病病菌接種后，感、抗病材料的SOD活性均呈先降低后升高的變化趨勢，且整個(gè)階段SOD活性喀西茄始終高于昆明紫長茄，表明喀西茄具有較高清除氧自由基和穩(wěn)定活性氧代謝平衡的能力。過氧化物酶(POD)在抗病機(jī)制中起間接作用，它可以通過影響植物體內(nèi)多種代謝途徑來提供抗性保護(hù)[21]。閆敏等[22]認(rèn)為被病原菌侵染后的植物體內(nèi)的POD活性變化與植株抗病能力相關(guān)，一般表現(xiàn)為抗病品種的POD活性增加程度高于感病品種，POD活性可作為病菌侵入的檢測手段之一，這在黃瓜與枯萎病菌[23]、西瓜與枯萎病菌[24]、南瓜與疫病菌[21]、棉花與枯萎病菌[25]以及煙草與低頭黑病菌[26]等較多的互作體系研究中得到了證實(shí)。在本研究中，喀西茄和昆明紫長茄葉片的POD活性在黃萎病病菌侵染后均增加，前期POD活性喀西茄高于昆明紫長茄，POD活性升高誘導(dǎo)植物體內(nèi)形成木質(zhì)素和植保素，這兩者可以通過限制黃萎病毒素的入侵和擴(kuò)散來增強(qiáng)喀西茄的抗性。后期POD活性昆明紫長茄超過喀西茄，可能是由于病菌的侵染損害了感病材料昆明紫長茄的膜系統(tǒng)，膜透性的增加，造成酶與底物無限制接觸，使得過氧化物酶催化的反應(yīng)加速，過氧化物酶活性提高。前人研究發(fā)現(xiàn)，病原菌侵染植物普遍會造成PAL活性升高。病原菌侵染植株后，抗病品種體內(nèi)的PAL活性變化比感病品種更大[1, 21]。而李海蓮等[11]認(rèn)為感、抗病品種接種后PAL活性相對穩(wěn)定。本研究中，黃萎病病原菌侵染前、后，葉片PAL活性喀西茄均高于昆明紫長茄，表明PAL活性的變化與茄子對黃萎病抗性呈正相關(guān)。張俊華等[21]認(rèn)為，病原菌感染誘導(dǎo)升高都表現(xiàn)出一個(gè)時(shí)間進(jìn)程，分為遲緩期、高峰期和消退期。本研究僅觀察到高峰期和消退期，可能是由于觀測時(shí)間點(diǎn)間隔較長，下一步有待于驗(yàn)證。CAT也是參與活性氧代謝過程中的重要保護(hù)酶之一，其功能是清除病原物侵染引起的活性氧積累，為植株提供抗性保護(hù)。前人研究發(fā)現(xiàn)，褐紋病菌侵染植株后，高抗品種的抗性機(jī)制比感病品種反應(yīng)更為迅速，高抗品種CAT活性不斷升高促進(jìn)了抗性物質(zhì)的積累與貯藏，能夠有效地抵御褐紋病菌的入侵，從而使其表現(xiàn)出較高的抗病能力[9]。而周寶利等[27]則認(rèn)為，不同品種的茄子在接種黃萎病菌后CAT活性存在差異，但與抗病性無明顯關(guān)系。本研究中，黃萎病菌侵染后喀西茄和昆明紫長茄的葉片CAT活性出現(xiàn)波動，最終均低于接種前。

圖11 不同茄子材料接種大麗輪枝菌后相對電導(dǎo)率的變化Fig.11 Changes of relative conductivity in different eggplant materials after V. dahliae inoculation

圖12 不同茄子材料接種大麗輪枝菌后MDA含量的變化Fig.12 Changes of MDA content in different eggplant materials after V. dahliae inoculation

葉綠素是綠色植物進(jìn)行光合作用、積累有機(jī)營養(yǎng)的主要色素，其含量的高低決定了光合作用的強(qiáng)弱，因此，葉綠素與植物生長能力密切相關(guān)[28]。蘋果葉片葉綠素含量會因?yàn)楹职卟【那秩径档?，并且褐斑病菌也會加劇葉片膜脂過氧化程度，造成葉片光合能力下降[29]。本研究中，抗病品種葉綠素含量始終高于感病品種，抗病品種喀西茄被侵染后，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量變化趨勢一致，均為先下降后升高。而侵染后的昆明紫長茄葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量相對穩(wěn)定。說明昆明紫長茄中可能存在某種緩解葉綠素降解的防御機(jī)制，能形成更嚴(yán)密的防御機(jī)制，維持葉綠素的穩(wěn)定性。除上述光合色素外，還有類胡蘿卜素，其不僅在光合作用中起到一定的作用，同時(shí)，還能作為植物體在長期的進(jìn)化中衍生出的非酶促保護(hù)系統(tǒng)來減少或阻止氧化損傷[30]。本研究結(jié)果顯示，葉片類胡蘿卜素含量喀西茄始終高于昆明紫長茄，黃萎病病菌侵染后植株類胡蘿卜素含量雖然出現(xiàn)波動但整體呈升高趨勢，可能是侵染后植株產(chǎn)生大量類胡蘿卜素，能夠減少或阻止活性氧帶來的氧化損傷，從而為膜系統(tǒng)的完整性提供保護(hù)。

本研究結(jié)果顯示，感、抗病品種可溶性蛋白含量均在接種后呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢?？扇苄缘鞍缀肯陆档脑蚩赡苁屈S萎病病菌的侵染導(dǎo)致可溶性蛋白降解，而降解產(chǎn)物不僅可以參與喀西茄抗黃萎病的生化反應(yīng)，也會參與抗性物質(zhì)如木質(zhì)素的合成，從而為植株提供抗性保護(hù)[31]。侵染后期可溶性蛋白含量增加可能是因?yàn)椴≡罅繌?fù)制降低了植株抗性。研究發(fā)現(xiàn)，感病品種昆明紫長茄在侵染后可溶性糖含量持續(xù)升高，其原因可能是病原菌侵染后分解植物細(xì)胞壁為其提供能量，從而使可溶性糖含量增加。而抗病品種喀西茄可溶性糖含量呈現(xiàn)先降低后升高，可能是因?yàn)榍秩竞笾参矬w內(nèi)合成抗病性物質(zhì)如木質(zhì)素、植保素等消耗了可溶性糖含量，再加之侵染后呼吸作用增強(qiáng)，光合速率降低，導(dǎo)致可溶性糖合成下降。

相對電導(dǎo)率是衡量植株在逆境條件下受損傷程度的指標(biāo)之一，當(dāng)脂膜的選擇透性被破壞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，當(dāng)環(huán)境介質(zhì)為水時(shí)，導(dǎo)電性會升高。本研究顯示，感、抗病品種接種后7～14 d相對電導(dǎo)率均顯著升高，說明黃萎病病原菌侵染植株嚴(yán)重?fù)p傷了寄主細(xì)胞的細(xì)胞膜，使得膜系統(tǒng)的選擇透性被破壞。而接種后7～14 d相對電導(dǎo)率喀西茄與昆明紫長茄相比增加幅度較小，可能是喀西茄是抗性品種，本身具有較強(qiáng)的自我調(diào)節(jié)能力，并且其體內(nèi)保護(hù)酶系活性也比較高，相較于感病品種昆明紫長茄能夠有效減輕黃萎病病菌帶給細(xì)胞的損害[9]。MDA是植物體內(nèi)脂膜過氧化的最終產(chǎn)物，它不僅能夠抑制細(xì)胞保護(hù)酶的活性，還能加劇膜的損傷[31]。本研究表明，病菌侵染后昆明紫長茄和喀西茄葉片MDA含量的變化趨勢相同，但昆明紫長茄在接種后MDA積累的多，說明活性氧對于昆明紫長茄膜系統(tǒng)的損害更嚴(yán)重，進(jìn)而導(dǎo)致了寄主對黃萎病菌抗性的降低?？ξ髑言诮臃N后，MDA含量增加的少，可能是因?yàn)橐恍┥砘钚晕镔|(zhì)或其防御酶系統(tǒng)及早發(fā)揮作用，故引起的生物膜損傷的程度也小，增加了其抗性。

4 結(jié) 論

植物在逆境條件下受到的傷害與植物本身的種類、逆境持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度有關(guān)[1]。在黃萎病病菌侵染過程中，喀西茄體內(nèi)各生理生化防衛(wèi)反應(yīng)的變化表明，喀西茄有較強(qiáng)的抗黃萎病的能力，在其體內(nèi)防御酶系統(tǒng)的效率和某些保護(hù)性物質(zhì)(如類胡蘿卜素等)的形成，可以減緩或降低MDA等有害物質(zhì)在植株體內(nèi)的積累。但是，在黃萎病病菌侵染過程中，對于喀西茄體內(nèi)各生理生化指標(biāo)的變化起決定性作用的是能特異編碼抗病性機(jī)制的基因還是寄主植物的細(xì)胞質(zhì)基因尚未明確，亦或這些變化只是植物體抗病性的表現(xiàn)，還有待于下一步研究論證。本研究還發(fā)現(xiàn)，喀西茄與昆明紫長茄葉片防御酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量以及相對電導(dǎo)率和MDA含量的變化趨勢高度一致，結(jié)果提示，喀西茄黃萎病抗性機(jī)制可能與昆明紫長茄相似。同時(shí)，喀西茄葉片中保護(hù)酶活性、光合色素和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量在14 d內(nèi)就迅速作出響應(yīng)(指標(biāo)明顯升高或降低)，且PAL、POD和SOD等指標(biāo)顯著高于昆明紫長茄，暗示喀西茄黃萎病抗性比昆明紫長茄高，這與前期田間抗性鑒定結(jié)果一致。