靈芝多糖肽對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7活性、遷移和細(xì)胞凋亡的影響

黃在興，劉凌云，陳 華，翁伯琦，林占熺，劉朋虎*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；3. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，福建 福州 350002)

【研究意義】肝癌是位列世界第六大最常見(jiàn)的癌癥，也是全球癌癥死亡的第四大原因[1]。肝癌中約90 %為肝細(xì)胞型肝癌(HCC)[2]， HCC的極強(qiáng)局部擴(kuò)散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力是其術(shù)后高復(fù)發(fā)的重要原因[3-4]，也是導(dǎo)致癌癥患者死亡的重要原因[5]。目前，HCC臨床治療主要有手術(shù)切除、化療、化學(xué)藥物治療、分子靶向治療等，以上治療方式存在治療效果不佳、價(jià)格昂貴、副作用大等缺點(diǎn)。近年來(lái)，因中草藥具有藥效明顯、副作用小、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，其抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究是當(dāng)今的熱點(diǎn)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】靈芝為擔(dān)子菌綱(Polyporales)多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬(GanodermaKarst.)，是我國(guó)法定藥材之一[6]。靈芝多糖肽(Ganoderma lucidum polysaccha—rides peptide，GL-PP)作為靈芝重要活性成分之一[7-8]，具有抗氧化和損失保護(hù)作用[9-12]，Kim[13]從靈芝提取到一種蛋白多糖，并證明該蛋白多糖對(duì)小鼠S-180肉瘤有明顯的抑制作用。目前，對(duì)靈芝抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫的作用多集中在靈芝多糖上[14-17]，而有關(guān)靈芝多糖肽抗腫瘤作用的報(bào)道較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究用GL-PP處理人肝癌細(xì)胞Huh7，分析GL-PP對(duì)離體肝癌細(xì)胞活性，細(xì)胞遷移能力和細(xì)胞凋亡的影響。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為揭示靈芝多糖肽抗腫瘤機(jī)制及其應(yīng)用于肝癌治療提供理論依據(jù)。

表1 主要藥品與儀器

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌草靈芝多糖肽由福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心林樹(shù)錢(qián)教授提供(赤芝子實(shí)體用蛋白酶酶解后醇提取獲得)；肝癌細(xì)胞株Huh7由福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院提供；本實(shí)驗(yàn)所需其他主要藥品與儀器如表1所示。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GL-PP對(duì)肝癌細(xì)胞活性的影響 在96孔板中接種5000個(gè)肝癌細(xì)胞和正常的肝臟細(xì)胞，用100 μl不同濃度的GL-PP溶液(0, 50, 100, 200 μg/mL)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，放置在培養(yǎng)箱(37 ℃，5 % CO2)中過(guò)夜； 24 h后換液，向每孔加入100 μl含10 μl CCK8溶液的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h；培養(yǎng)結(jié)束后，在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處的吸光度。

按如下公式計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力(100 %)=(實(shí)驗(yàn)組吸光度-空白組吸光度)/(對(duì)照組吸光度-空白組吸光度)。

1.2.2 GL-PP對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響 用不同濃度的GL-PP溶液(0, 100, 200 μg/mL)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞并制備細(xì)胞懸液；在8 μm規(guī)格的Transwell小室濾膜上加入10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，用100 μl含0.5 μl BSA的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在下層加入600 μl含10 %胎牛血清(加相應(yīng)濃度的多糖)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基；培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，棄孔中的培養(yǎng)液，用無(wú)鈣的PBS緩沖液沖洗2遍，再用甲醇固定30 min，將小室適當(dāng)風(fēng)干。等風(fēng)干后，用濃度為0.1 %的結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，再用PBS緩沖液沖洗3遍，最后放置在400倍顯微鏡下觀察上室內(nèi)細(xì)胞遷移情況。

1.2.3 GL-PP對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響 在24孔板中接種5萬(wàn)個(gè)肝癌細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)到80 %匯合率時(shí)，加入不同濃度的GL-PP溶液(0、50、100、200 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜；24 h后，收集細(xì)胞，用PBS緩沖液沖洗2次， 300 g 離心5 min；用100 μl 1×Annexin V binding solution重懸細(xì)胞，向細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC結(jié)合物，再加入5 μl PI solution?；旌暇鶆蚝螅覝叵卤芄夥跤?5 min并不時(shí)振蕩；孵育結(jié)束后，加入200 μl 1×Annexin V binding solution并進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)整理采用Microsoft Excel，差異性分析采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，繪圖采用GraphPad Prism，用FlowJo軟件對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GL-PP對(duì)肝癌細(xì)胞活性的影響

本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度GL-PP(0～200 μg/mL)對(duì)肝癌細(xì)胞活性的影響(圖1)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨培養(yǎng)基里的GL-PP濃度的增加，培養(yǎng)得到的肝癌細(xì)胞Huh7的細(xì)胞活性略微下降，且濃度越高活力下降越多，但差異性不顯著，說(shuō)明本試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，GL-PP對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7活力影響不大。

2.2 GL-PP對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響

Transwel細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示， 中濃度(100 μg/mL)的GL-PP，相比對(duì)照組(CK)的肝癌細(xì)胞遷移數(shù)量明顯減少，高濃度(200 μg/mL)的GL-PP，相比中濃度(100 μg/mL)肝癌細(xì)胞的遷移數(shù)量明顯下降，以上結(jié)果表明在濃度0～200 μg/mL范圍內(nèi)，GL-PP隨著濃度的增加對(duì)肝癌細(xì)胞的遷移抑制效果越來(lái)越明顯，具有一定的量效關(guān)系。

2.3 GL-PP對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

本研究用不同濃度的GL-PP溶液處理肝癌細(xì)胞，用FlowJo軟件進(jìn)行分析，得到熒光雙染色二維點(diǎn)圖如圖3所示， Q1表示(AnnexinV-FITC)-/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為壞死細(xì)胞，也可能有少數(shù)的晚期凋亡細(xì)胞在其中，甚至機(jī)械損傷的細(xì)胞也包含其中；Q2表示(AnnexinV+FITC)-/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞；Q3表示(AnnexinV-FITC)+/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞；Q4表示(AnnexinV-FITC)-/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡率的方法通常采用Q2+Q3。

根據(jù)熒光染色二維點(diǎn)圖，對(duì)凋亡率的差異性進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示，當(dāng)添加的GL-PP濃度為50和100 μg/mL時(shí)，培養(yǎng)得到的肝癌細(xì)胞Huh7的凋亡率和空白對(duì)照(0 μg/mL)相比沒(méi)有明顯的差異，顯著性不差異(P>0.05)；當(dāng)添加GL-PP的濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，肝癌細(xì)胞Huh7的凋亡率明顯上升，并且差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明高濃度(200μg/mL)的GL-PP對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7的凋亡有明顯的誘導(dǎo)作用。

圖1 不同濃度GL-PP對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7活力影響Fig.1 Effects of different concentrations of GL-PP on the viability of Huh7 cells

3 討 論

肝癌細(xì)胞的極強(qiáng)侵襲和轉(zhuǎn)移是肝癌復(fù)發(fā)的重要原因[18]，探索防止肝癌復(fù)發(fā)的有效干預(yù)策略是增加患者生存率的關(guān)鍵[19]。近年來(lái)，隨著中草藥抗腫瘤研究的深入，靈芝三萜化合物[20]、靈芝孢子粉[21]、靈芝孢子油[22]、靈芝酸[23]、靈芝多糖[24-25]、靈芝肽[26-27]等被相繼報(bào)道能有效抑制肝癌細(xì)胞遷移、增殖或誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。本研究探討了不同濃度的GL-PP對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7的活性、遷移和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)隨著GL-PP濃度的增加肝癌細(xì)胞Huh7活性越來(lái)越低，這表明GL-PP在0～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7的活性有一定的影響，但差異性不顯著(P>0.05)。GL-PP對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7的遷移具有明顯的抑制作用，這與曹琦珍[28]的研究結(jié)果(靈芝多糖肽處理的血清能夠有效抑制人肺癌細(xì)胞的增殖)相似，而腫瘤的侵襲和遷移是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，每個(gè)階段可以通過(guò)基因或者信號(hào)通路來(lái)調(diào)控[29]，靈芝多糖肽抑制肝癌細(xì)胞Huh7遷移的具體機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)低濃度(0～100 μg/mL)GL-PP對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7的凋亡無(wú)明顯誘導(dǎo)作用，但高濃度(200μg/mL)的GL-PP能夠明顯誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞Huh7凋亡(P<0.05)。有研究[30]報(bào)道靈芝多糖GL-B在小鼠體內(nèi)能增加腫瘤壞死因子α(TNF-α)和干擾素γ(IFN-γ)使腫瘤細(xì)胞凋亡，劉媛[14]的研究表明靈芝多糖還可通過(guò)增加NK細(xì)胞的活性來(lái)刺激TNF-α和IFN-γ的釋放，最終達(dá)到抗腫瘤作用。也有報(bào)道[31]證明靈芝多糖可阻滯人肝癌HepG2細(xì)胞于G0/G1期，并可誘導(dǎo)其凋亡，靈芝肽可使細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載從而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可以促使Bcl-2和survivin基因下調(diào)表達(dá)以及 p53基因上調(diào)表達(dá)，激活Caspase-3活性。因此，GL-PP在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)理是否與靈芝多糖或靈芝肽相同或相似也是值得深入研究的方面。

圖2 不同濃度GL-PP對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7遷移的影響Fig.2 Effects of different concentrations of GL-PP on migration of Huh7 cells

A:對(duì)照組CK； B、C、D圖中GL-PP添加濃度分別為50,100,200 μg/mL圖3 不同濃度的GL-PP對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7凋亡的影響Fig.3 Effects of different concentrations of GL-PP on apoptosis of Huh7 cells

表2 不同濃度GL-PP影響下肝癌細(xì)胞Huh7凋亡率的變化

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示不同處理之間的差異顯著(P<0.05)。

綜上所述，本研究證明了GL-PP能夠抑制肝癌細(xì)胞Huh7的遷移，高濃度的GL-PP可明顯誘導(dǎo)Huh7的凋亡， GL-PP對(duì)Huh7的活性影響不顯著，但GL-PP 對(duì)Huh7的作用機(jī)制尚未清楚，這是今后研究的努力方向，本次研究結(jié)果可為揭示GL-PP對(duì)肝癌作用機(jī)制提供基礎(chǔ)依據(jù)，為用于肝癌輔助治療提供科學(xué)依據(jù)。