pho2 突變體礦質(zhì)元素含量及耐鹽性分析

朱振興，李 丹，王春語(yǔ)，張麗霞，陸曉春

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物分子改良實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110161)

【研究意義】磷元素是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必須的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)之一，由于磷礦是不可再生資源，在不久的將來面臨磷礦資源的枯竭[1]。然而在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中，施用的磷肥僅有大約1/3的肥料被當(dāng)季作物所利用，其余大量肥料被浪費(fèi)，這樣既不經(jīng)濟(jì)，也不環(huán)保，經(jīng)常造成水體污染事件發(fā)生[2]。培育磷養(yǎng)分高效作物，是可持續(xù)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要途徑之一，因此研究磷元素分子生理調(diào)控機(jī)制有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在擬南芥和水稻中，對(duì)磷饑餓信號(hào)響應(yīng)都有比較深入的研究[3-4]。其中AtPHO2是一個(gè)重要磷信號(hào)調(diào)控基因，編碼了泛素E2連接酶，通過泛素化作用降解AtPHO1蛋白，從而抑制了AtPHO1基因的功能，AtPHO1基因的主要功能是在木質(zhì)部進(jìn)行磷元素的轉(zhuǎn)載和輸出。在水稻中鑒定出有3個(gè)AtPHO1的同源基因，分別是OsPHO1;1，OsPHO1;2和OsPHO1;3。OsPHO1;2基因鑒定出來是在水稻中木質(zhì)部進(jìn)行磷元素裝載和輸出，從而將磷元素從根系轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部分[5-7]。OsPHO2還可以通過泛素化降解機(jī)制，調(diào)控PHT1蛋白在內(nèi)膜上的含量，達(dá)到調(diào)控磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的目的[8]。另外OsPHO2轉(zhuǎn)錄本也會(huì)被miRNA399所降解，從而可以反饋抑制OsPHO2基因的表達(dá)[9]。水稻中OsPHO2基因的突變，會(huì)造成突變體植株地上部磷元素超量累積，甚至高達(dá)數(shù)倍[10]。【本研究切入點(diǎn)】筆者對(duì)OsPHO2基因的印象一般是只與磷有關(guān)的，但是否可能參與了其他礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的調(diào)控或是否對(duì)其他礦質(zhì)元素的影響，尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬分析日本晴野生型和日本晴背景ospho2突變體，在正常種植的條件下，地上部分和種子中的礦質(zhì)元素含量。離子測(cè)試的結(jié)果表明Na離子的含量在水稻和高粱pho2中都有大量累積，而Na離子的含量是植物耐鹽的重要指標(biāo)之一[11-12]。本文擬開展水稻和高粱pho2突變體萌芽期耐鹽實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料種植條件

日本晴野生型WT和ospho2突變體(中科院遺傳發(fā)育所儲(chǔ)成才研究員提供的水稻ospho2突變體)，發(fā)芽后進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)液水培10 d。使用木村氏培養(yǎng)液，大量元素MgSO4·7H2O (0.5470 mM); (NH4)2SO4(0.3650 mM); KH2PO4(0.1820 mM); KNO3(0.1830 mM); Ca(NO3)2·4H2O (0.3660 mM); 微量元素MnCl2·4H2O (0.0005 mM); H3BO3(0.0030 mM); (NH4)6Mo7O24·4H2O(0.0001 mM); ZnSO4·7H2O(0.0004 mM);CuSO4·5H2O (0.0002 mM); NaFe-EDTA·3H2O (0.0400 mM)，調(diào)節(jié)pH值到5.5。移栽于10 kg土壤均一的塑料桶中，一桶挑選2株大小一致的苗，WT和突變體各種植3桶，共6桶。在室外種植2個(gè)月左右，6-7月的沈陽(yáng)，然后搬到溫室中白天30℃/12h， 晚上22℃/12h，光強(qiáng)約3萬(wàn)lx, 濕度控制在70 %左右，直至開花結(jié)實(shí)，成熟。因水稻品種日本晴在沈陽(yáng)夏季自然的室外條件下，沈陽(yáng)日照時(shí)間較長(zhǎng)，日本晴不易正常抽穗，所以進(jìn)行這樣種植方式。

1.2 金屬礦質(zhì)元素含量的測(cè)定

在日本晴和ospho2突變體成熟后，收取稻穗后，收獲每個(gè)樣品地上部分，先120 ℃殺青20 min，然后80 ℃，烘干至恒重約2～3 d時(shí)間。測(cè)定時(shí)每個(gè)樣品取2株長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，地上混合在一起，然后用機(jī)器粉碎成粉末狀。日本晴和ospho2突變體每個(gè)品種2個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)包含兩株苗的均勻混合。礦質(zhì)元素測(cè)定時(shí)，采用ICP-OES(Optima 8x00，PerkinElmer，USA)測(cè)定金屬元素的含量。樣品稱取0.1 g左右，加濃硝酸5 mL，0.5～1 mL H2O2，然后采用微波消解儀MARS 6.0(CEM，USA)，按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行微波消解，最終溶液呈無色透明狀，然后通過約200 ℃高溫加熱，進(jìn)行趕酸至約0.5 mL，最后定容至50 mL，其后按照儀器的操作規(guī)程進(jìn)行金屬元素含量的測(cè)定。

1.3 總磷含量的測(cè)定

樣品的處理同上，稱取樣品0.1 g左右，微波消解儀硝化完后，趕酸、定容至50 mL，然后利用流動(dòng)分析儀(San++System，SKALAR，Netherlands)，采用鉬酸銨顯色法測(cè)定總磷的含量。

1.4 水稻和高粱pho2突變體耐鹽性比較

高粱或是水稻干種子在10 mL離心管中，首先用5 %次氯酸鈉溶液消毒5 min，然后用滅菌水清洗洗3～4遍，然后在培養(yǎng)皿中鋪上兩層濾紙片，加上適量滅菌水或是1.2 %的NaCl溶液，放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后觀察萌芽成苗狀態(tài)。植株的表型照片使用相機(jī)進(jìn)行拍攝(EOS 5D, Canon, Japan)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel2007進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異性顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟期地上部日本晴野生型和ospho2突變體礦質(zhì)元素含量分析

在成熟期時(shí)，盆栽中的野生型日本晴和ospho2突變體，取樣測(cè)定地上部分中的礦質(zhì)元素含量，包括大量元素和微量元素。結(jié)果表明在ospho2突變體中總磷的含量超量累積，總磷的含量幾乎是野生型中的4倍(圖1-A)。不僅總磷的含量有所改變，其他元素含量也有改變。其中鉀(K)元素含量在突變體中增加了約16 %，另外Mg元素的含量也增加了47 %，Ca元素也有增加，但是統(tǒng)計(jì)上并不顯著(圖1-A)。在微量元素的分析上，也有含量上有顯著差異的元素。Na, Zn, Cu總的含量較野生型沒有顯著性差異，但是Fe元素的含量較野生型是顯著降低，而錳元素Mn的含量較野生型顯著增加的，增加了將近84 %的量(圖1-B)。

A. 野生型日本晴和突變體ospho2地上部大量元素磷、鉀、鎂和鈣的分析； B. 野生型日本晴和突變體ospho2地上部微量元素鈉、錳、鐵、銅和鋅的分析A. Macroelement contents of Nip and mutant ospho2; B. Microelement contents of Nip and mutant ospho2, star indicates as student’ T test, * 0.01 P<0.05, ** P < 0.01圖1 成熟期野生型日本晴和突變體ospho2地上部離子含量Fig.1 Shoot ion contents of wild-type Nip and mutant ospho2 at maturity stage

A. 野生型日本晴和突變體ospho2種子中大量元素磷、鉀、鎂和鈣的分析；B. 野生型日本晴和突變體ospho2種子中微量元素鈉、錳、鐵、銅和鋅的分析, 星號(hào)代表student’ T 檢測(cè)，* 0.01 P < 0.05，** P < 0.01A. Macroelement contents of Nip and mutant ospho2; B.Microelement contents of Nip and mutant ospho2, star indicates as student’T test, * 0.01 P < 0.05, ** P < 0.01圖2 野生型日本晴和突變體ospho2種子中離子含量Fig.2 Seed ion contents of wild-type Nip and mutant ospho2

2.2 成熟期時(shí)日本晴野生型和ospho2突變體種子中礦質(zhì)元素改變情況

在盆栽條件下野生型和ospho2突變體成熟時(shí)期，我們對(duì)其種子進(jìn)行礦質(zhì)元素含量分析。結(jié)果表明，在種子中，總磷的含量突變體較野生型是顯著增加的，但是遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有達(dá)到在地上部分積累的程度，相對(duì)野生型種子僅增加了30.27 %；其中鉀元素的含量也有所增加，在種子中較野生型增加了92.29 %；Mg、Ca和Zn元素的含量也顯示出了顯著的增加；特別是Na元素在突變體中極顯著的增加，其他元素如Mn、Fe、Cu的含量并沒有統(tǒng)計(jì)上顯著的差異變化(圖2)。研究表明在ospho2的突變體中有大量的非磷元素也有累積效應(yīng)，特別是金屬元素，不論是在種子中或是地上部分。

2.3 稻和高粱pho2突變體萌發(fā)期耐鹽性比較

因在水稻ospho2突變體中，Na元素的含量顯著累積(圖2)，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的高粱EMS突變體庫(kù)中[13]也篩選并克隆了高粱sbpho2突變體，在種子中Na元素的含量較野生型也是顯著增加(未發(fā)表的數(shù)據(jù))。因Na離子含量是植株是否耐鹽的重要指標(biāo)之一，為了研究是否種子中過量累積的Na元素，會(huì)影響種子萌發(fā)期的耐鹽特性，開展了鹽脅迫實(shí)驗(yàn)。通過以前的預(yù)實(shí)驗(yàn)，將NaCl的濃度定位1.2 %。高粱和水稻對(duì)鹽脅迫處理的反應(yīng)有不同。在鹽脅迫處理下，水稻中野生型的芽苗率逐步上升，最終達(dá)到平臺(tái)期，而高粱中野生型芽苗率呈現(xiàn)從高峰逐漸下降的過程(圖3-A和C)。因?yàn)楦吡恢杏行┓N子在鹽脅迫下盡管開始時(shí)能夠萌芽，但是隨著鹽處理天數(shù)增加會(huì)逐步死亡，而水稻的觀察是只要種子萌芽了就會(huì)逐漸生長(zhǎng)。水稻和高粱pho2突變體在鹽處理下較野生型芽苗率明顯降低，相對(duì)芽苗率可以直觀看到這一點(diǎn)，特別是在高粱中(圖3-B和D)。盡管在水稻中僅鹽處理下第4天，突變體芽苗率較野生型在統(tǒng)計(jì)上有顯著差異。在高粱中突變體在所有的時(shí)間點(diǎn)，較野生型都是統(tǒng)計(jì)上的顯著差異。從15 d鹽脅迫表型照片，在對(duì)照條件下，高粱或是水稻pho2突變體較其野生地上部分生長(zhǎng)狀態(tài)差不多，而在鹽脅迫條件下高粱或是水稻pho2突變體地上部分生長(zhǎng)較野生型都有所抑制(圖3-E到H)。這些數(shù)據(jù)都表明高粱和水稻pho2降低了植株對(duì)鹽脅迫的抗性。

A、C分別顯示水稻和高粱在1.2 % NaCl處理下不同時(shí)間點(diǎn)的芽苗率；B、D分別顯示水稻和高粱在1.2 % NaCl處理下不同時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)芽苗率；E、F代表水稻和高粱野生型和pho2突變體在0 % NaCl下處理15 d時(shí)的表型；G、H代表水稻和高粱野生型和pho2突變體在1.2 % NaCl處理15 d時(shí)的表型，星號(hào)代表student’ T 檢測(cè)，* 0.01 P < 0.05，** P < 0.01A and C：Seeds germination and seedlings survival rates of rice and sorghum plants under 1.2 % NaCl treatment;B and D: Relative seeds germination and seedlings survival rates of rice and sorghum plants under 1.2 % NaCl treatment; E and F: Phenotypes of rice and sorghum WT and mutant pho2 after 0 % NaCl 15 days treatment; G and H: Phenotypes of rice and sorghum WT and mutant pho2 after 1.2 % NaCl 15 days treatment, star indicates as student’T test, * 0.01 P<0.05, ** P<0.01圖3 水稻高粱pho2突變體耐鹽性比較Fig.3 Comparison of rice and sorghum pho2 salt resistance

3 討 論

首先簡(jiǎn)單總結(jié)一下磷饑餓信號(hào)的傳導(dǎo)途徑。以水稻中的磷信號(hào)途徑為例，以O(shè)sPHR2轉(zhuǎn)錄因子為核心。在磷饑餓的條件下，OsPHR2激活下游各種PSI磷饑餓響應(yīng)基因，如上調(diào)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體基因，上調(diào)SQD或是PAP酸性磷酸酶，另外OsPHO2也會(huì)通過miRNA827或是miRNA399反饋抑制調(diào)控NLA(Nitrogenlimitationadaptation)或是OsPHO2的表達(dá)水平[14]，而OsPHO2主要作用是抑制了OsPHO1(在木質(zhì)部進(jìn)行磷元素的裝載和進(jìn)行磷酸鹽的輸出efflux)。以及通過泛素化降解，調(diào)整了PHT1家族磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的含量，達(dá)到調(diào)控磷吸收的目的。同時(shí)SPX蛋白可以通過與OsPHR2蛋白的互作，反饋抑制磷的激活信號(hào)。而SPX蛋白基因可以通過結(jié)合OsPHR2對(duì)其產(chǎn)生抑制作用，從而抑制其對(duì)下游基因的激活作用[15]。另外IPS1/2基因可以通過與miRNA399 mimic作用，可以降解miRNA399而最終反饋調(diào)控它的表達(dá)，從而達(dá)到一個(gè)調(diào)控miRNA399的作用，這個(gè)基本上就是磷信號(hào)的調(diào)控途徑。

OsPHO2基因編碼的是一個(gè)泛素E2連接酶，在磷信號(hào)途徑中主要起負(fù)調(diào)控作用。在磷元素充足的條件下，OsPHO2通過泛素化降解了OsPHO1蛋白，而OsPHO1的功能是負(fù)責(zé)在磷元素從地下部分木質(zhì)部轉(zhuǎn)運(yùn)磷元素到地上部分。另外推測(cè)OsPHO2可能會(huì)對(duì)SPX gene 或是其他磷饑餓響應(yīng)基因(PSIgenes)有間接的抑制作用，但是缺乏直接的證據(jù)。對(duì)OsPHO2的功能已經(jīng)有很多的研究，突變后造成類似于激活了磷饑餓的信號(hào)，它在磷信號(hào)途徑中的關(guān)鍵作用，也有一定的了解，但是對(duì)其他礦質(zhì)元素的影響，基本沒有太多的了解和報(bào)道。先前的報(bào)道表明在水稻ospho2突變體中，地上部總的硝態(tài)氮含量較野生型是顯著降低，可能是由于一個(gè)硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)體以及硝酸鹽還原酶在根中的表達(dá)量降低，導(dǎo)致從根中向地上部分運(yùn)輸量的減少。另外Fe的含量也在ospho2突變體顯著根中增加，鐵和磷的信號(hào)有一定的相互作用，在ospho2突變體中根部有顯著的鐵累積，地上部分Fe的積累并不顯著。很多Fe響應(yīng)基因在突變體中表達(dá)上調(diào)了，如OsNAS1,OsNAS2,OsIRT1以及OsYSL15在突變體中的表達(dá)顯著上調(diào)了，最終促進(jìn)了植株Fe元素的吸收，造成在突變體根中累積了大量的Fe元素[10, 16]。初步的研究表明，OsPHO2基因的突變不僅僅是造成磷元素的超量積累，也造成了其他礦質(zhì)元素含量的改變，大部分是增加。通過對(duì)成熟期的WT日本晴和突變體ospho2，測(cè)定成熟期地上部分和種子的礦質(zhì)元素的含量，研究表明在ospho2突變的情況下，在地上部分，除了磷元素大量的累積外，也發(fā)現(xiàn)了其他元素也累積了很多金屬元素，諸如，鉀、鎂、鐵和錳元素的含量在突變體的地上部分顯著的累積，鉀、鎂、鈣、鈉以及鋅等元素在突變體種子中，也有顯著的增加。在突變體的種子中或是地上部，礦質(zhì)元素累積的趨勢(shì)都是差不多。不同的是在種子磷累積的量并沒有如地上部分累積的那么多，僅僅較野生型有30 %的增加，可能是因?yàn)榱自貜牡厣舷蚍N子中運(yùn)輸?shù)臅r(shí)候，此時(shí)沒有更多的磷相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體并沒有被OsPHO2調(diào)控的或是相關(guān)的PSI基因調(diào)控的程度并沒有較地上部分那么高。相比較而言，其他非磷元素的在突變體種子中的累積量較地上部分趨勢(shì)是差不多，可能這些元素向籽粒中運(yùn)輸?shù)南嚓P(guān)的基因表達(dá)量較地上部分是差不多的。所以這些元素的增加，可能是由于其相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)量被上調(diào)了，或是也有可能是鰲合的金屬元素的釋放增加了，造成這些元素的含量的增加。另外的可能性可能是OsPHO2可能直接或是間接調(diào)控了這些基因的表達(dá)或是蛋白的含量，最后，這些基因可能是這些金屬元素運(yùn)輸?shù)闹匾霓D(zhuǎn)運(yùn)體。另外現(xiàn)在的研究也表明有些鉀高親和轉(zhuǎn)運(yùn)體也可以進(jìn)行一價(jià)或是二價(jià)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，如Na, K, Cu, Zn, Mg, Ca 以及Fe等元素，也有可能是這些轉(zhuǎn)運(yùn)體將其他離子帶入到植株體內(nèi)[17]，是否是直接或是間接，就有待今后的研究來證明這些猜想或是產(chǎn)生的疑惑。初步的研究結(jié)果強(qiáng)烈表明OsPHO2基因可能的多樣性功能，我們的結(jié)果為將來的深入研究提供了有用的線索。

培育耐鹽作物是未來增加糧食產(chǎn)量重要的研究方向之一，植物體內(nèi)Na離子的含量是植株耐鹽特性的重要指標(biāo)之一，在大麥水稻作物中有一定的研究[11-12]。因水稻和高粱的pho2突變體種子中超量累積Na離子，進(jìn)行了種子在萌芽期的耐鹽試驗(yàn)。結(jié)果也表明水稻和高粱pho2突變體降低了，萌芽期對(duì)鹽的抗性。推測(cè)因pho2造成植株Na離子的增加，而間接造成了突變體對(duì)鹽脅迫的耐性下降。同時(shí)也看到了水稻和高粱在萌芽期的耐鹽特性的不同。在鹽脅迫下水稻萌芽后，一般就能逐漸長(zhǎng)成苗，而高粱種子即使萌芽后，也有可能植株逐漸死亡。

通過本研究，發(fā)現(xiàn)了在ospho2突變體中有大量其他非磷金屬元素的累積，甚至在種子都有積累。但是在種子中，也積累很多其他的元素。這些非磷元素增加，是OsPHO2的直接作用，還是間接的作用，有待進(jìn)一步的研究。這個(gè)深入的研究，為揭開ospho2突變體中調(diào)控其他礦質(zhì)元素的作用，或是揭開磷元素和其他元素互作的機(jī)理。將來可通過表達(dá)譜或是蛋白組等技術(shù)研究在突變體中，哪些元素有關(guān)運(yùn)輸相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體之類的基因或是蛋白表達(dá)的差異，可能揭示這些營(yíng)養(yǎng)元素差異的原因?；蚴峭ㄟ^最新的基因編輯技術(shù)進(jìn)行基因敲除，在ospho2背景下敲除一些相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)基因，為探索不同基因作用機(jī)制的不同，為全面解析OsPHO2的功能提供了可能的解決辦法。

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在水稻ospho2突變體中不僅只有磷元素的改變，其他很多非磷元素也有改變。水稻和高粱pho2突變體萌芽期對(duì)鹽脅迫的抗性下降。