胞外聚合物對厭氧消化酸化預警作用的研究

馮江華 韓國然 朱 凱 朱保寧

(北京化工大學 化學工程學院， 北京 100029)

引 言

厭氧消化是近年來我國餐廚垃圾處理領域的熱點技術之一。有機物的厭氧微生物代謝過程可分為水解、產酸和產甲烷三大階段，其中產酸階段速率最快，不易控制[1]。由于餐廚垃圾富含易降解的有機質、油脂含量高[2]等特點，當厭氧消化過程的系統(tǒng)運行參數發(fā)生快速變化，尤其是在高負荷下，產酸階段產生的大量揮發(fā)性脂肪酸(VFA)難以在產甲烷階段被及時消耗，不僅酸積累導致體系pH值快速下降，而且過量的VFA抑制產甲烷菌的活性，從而導致系統(tǒng)失穩(wěn)甚至酸敗。因此，厭氧系統(tǒng)失穩(wěn)狀態(tài)的診斷和預警一直是工程化推廣中的難題。

目前在研究和實際生產中常用pH值、產氣量、產氣成分、堿度、VFA等作為厭氧過程穩(wěn)定性的指示性參數。何清明[3]在餐廚垃圾厭氧消化沖擊試驗中定義甲烷產率連續(xù)下降幅度達到50%的首日時間為系統(tǒng)失穩(wěn)時間；彭緒亞等[4]選取碳酸氫鹽堿度(DBA)與總堿度(DTA)的比值及揮發(fā)性脂肪酸總濃度(DVFA)與碳酸氫鹽堿度的比值作為酸化抑制的指示性指標，提出當DVFA/DBA>0.8及DBA/DTA<0.4時，系統(tǒng)的緩沖能力下降，標志著酸化的發(fā)生；Polag等[5]在線監(jiān)測甲烷的穩(wěn)定碳同位素(δ13CCH4)，發(fā)現(xiàn)δ13CCH4值比傳統(tǒng)指標提前5～10 d發(fā)生變化；Li等[6]則建議使用厭氧生物產氣中甲烷與二氧化碳的體積比作為工程應用的厭氧消化預警指標。然而，這些參數在用于表征厭氧微生物的活性時通常存在一定的滯后性，往往在微生物代謝已經失衡后才表現(xiàn)出明顯的波動。在工程上，若能提早發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)失穩(wěn)并做出相應調整，能夠大大減少不必要的損失，同時提高體系運行效率。因此，開發(fā)一種能夠及時反映系統(tǒng)酸化狀態(tài)的方法及確立新型預警指標顯得尤為重要。

胞外聚合物(EPS)是微生物在一定環(huán)境條件代謝過程中產生的一種用于自我保護和相互粘附的有機大分子聚合物。EPS的組成包括微生物代謝分泌物、細胞自溶物以及大分子物質的水解產物[7]，多糖和蛋白質約占EPS總質量的70%～80%。EPS與微生物細胞的生長狀態(tài)緊密相關，它在幫助微生物抵御外界不良環(huán)境的同時也加強了微生物細胞之間的溝通與社會合作，提高了微生物對于干燥以及有毒環(huán)境的耐受性[8-9]，在一定程度上可以反映系統(tǒng)狀態(tài)。

目前對EPS的研究主要集中在好氧顆粒污泥EPS聚集、解離與污泥理化性質的關系上[10]，例如胞外多糖對于增強細胞膜的機械穩(wěn)定性效果[8]、胞外蛋白對于改善微生物在高濃度乙酸環(huán)境中的適應性效果[11]，以及EPS對環(huán)境污染物的富集效應。目前，對于厭氧消化過程中EPS組分變化與微生物系統(tǒng)穩(wěn)定性之間的關聯(lián)關系研究仍然很少。

本研究針對餐廚垃圾厭氧消化在高負荷下容易酸化且缺乏有效預警指標的問題，在中溫條件下進行簡單體系的批式厭氧消化實驗。本文模擬了高負荷體系下餐廚垃圾的厭氧酸化過程并提取EPS，分析其多糖、蛋白質質量濃度變化規(guī)律。通過分析對比厭氧消化過程的pH值、產氣量、VFA質量濃度以及EPS成分等指標變化，探討使用EPS來診斷和預警厭氧消化系統(tǒng)失穩(wěn)酸敗的可能性。

1 實驗部分

1.1 實驗原料和裝置

1.1.1實驗原料

為減少原料帶來的干擾，實驗采用復配的簡單底物(無水葡萄糖，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；蛋白胨，分析純，北京奧博星生物技術有限公司；油脂，食用級，金龍魚植物園)模擬餐廚垃圾進行厭氧消化實驗。按照餐廚垃圾中主要成分的比例即葡萄糖∶蛋白質∶油脂=6∶3∶2(質量比)的配比分別投加葡萄糖、蛋白胨與植物油[12]。接種污泥取自順義大孫各莊東華山村沼氣站，其總固體含量(TS)為10.05%±0.08%，揮發(fā)性固體含量(VS)為6.12%±0.05%。接種污泥經自然沉降2 h后倒去上清液，存于4 ℃冰箱備用。污泥使用前置于35 ℃恒溫水箱中培養(yǎng)1 d活化。

1.1.2實驗裝置

厭氧反應器選用2.5 L下口出料瓶，其有效容積為1.5 L。出料瓶的上口用乳膠管陸續(xù)連至1 L廣口瓶和1 L燒杯，采用排水集氣法計量厭氧系統(tǒng)的產氣量。裝置如圖1所示。

實驗采用加熱- 陽離子樹脂法提取EPS[13]。取10 mL出料，以4 000 r/min離心5 min，棄去上清液后加入0.85%NaCl補給到10 mL；將樣品置于水浴鍋70 ℃加熱20 min后，在其中添加10 g陽離子樹脂(Dowex Marathon C sodium form，Sigma公司)并在三聯(lián)攪拌器中以200 r/min速率攪拌2 h；取出樣品，攪拌均勻后放入離心機中10 000 r/min離心10 min，過濾膜(尼龍66，0.45 μm，津騰公司)后得到EPS提取物。

1.2 實驗設計

本實驗選定污泥接種量為15 g/L(VS，即每L液體中含有的揮發(fā)性固體的克數)。按照底物與接種污泥的負荷比F/M(單位質量的活性污泥承受的有機物質量)=0.5、3、4(F/M=0.5稱為低負荷組，F(xiàn)/M=3、4稱為高負荷組，每個負荷比下設置3組平行實驗)分別在一系列相同的反應器中添加初始進料并使用蒸餾水補充反應體積為1.5 L；將物料充分搖勻后，置于35 ℃恒溫水箱，每隔2 h測定產氣量與產氣成分，并在搖勻后取出10 mL物料，測定出料的pH值和VFA質量濃度，提取出料的EPS并測定成分。實驗持續(xù)36 h，36 h之后體系不再產氣，徹底酸化并且不再恢復。

1.3 分析方法

pH值使用Thermo- 868型pH計(美國Thermo Orion公司)配合玻璃電極進行測定。氣體組分使用SP- 2100氣相色譜儀(北分瑞利)配合填充色譜柱和TCD檢測器進行測定，測試條件為：載氣使用氬氣(20 mL/min)，填充柱柱溫140 ℃，TCD溫度150 ℃，進樣口溫度150 ℃。VFA使用島津GC2014氣相色譜儀配合毛細色譜柱(Agilent，DB- WAX)和FID檢測器進行測定，測試條件為FID溫度250 ℃，使用高純氮氣作為載氣(30 mL/min)，自動進樣溫度250 ℃。氣體產量用如圖1所示的排水集氣法進行測定。EPS中的多糖質量濃度使用蒽酮硫酸法進行測定[14]；EPS中蛋白質的質量濃度使用改進的Lowry法進行測定[15]。

2 結果與討論

2.1 厭氧消化過程中的pH值變化

圖2為3個不同F(xiàn)/M下厭氧消化過程的pH值變化曲線?？梢钥闯霎擣/M=0.5時，pH值在15 h以內小幅下降，之后趨于穩(wěn)定并在6.85附近上下波動，直至36 h實驗結束；高負荷F/M=3、4的兩個體系的pH值下降則非常明顯，在實驗開始的26 h之內持續(xù)快速下降，在第15～22 h之間尤其迅速，直至pH值降到5.5以下才變?yōu)榫徛陆?，直至系統(tǒng)失穩(wěn)。黃安壽等[16]在餐廚垃圾高溫厭氧消化中發(fā)現(xiàn)pH值降低到6.5時，系統(tǒng)出現(xiàn)酸化。李蕾[17]在中溫厭氧消化反應中則發(fā)現(xiàn)當pH值下降至5.5以下時，嚴重背離了產甲烷菌的適宜pH值范圍，體系停止產氣。由于體系pH值的變化受到堿度、揮發(fā)性脂肪酸等多種因素的影響，系統(tǒng)酸化并沒有統(tǒng)一的pH值標準。

2.2 產氣量變化

不同的物料負荷對產氣量的影響較為明顯，負荷越高對產甲烷過程的抑制越明顯(圖3)。負荷低時厭氧消化3個階段底物與產物代謝速率較為平衡，單位揮發(fā)性固體累積產氣量處于穩(wěn)定上升階段；而對于F/M=3和F/M=4 兩個高負荷組，累積產氣量在第16 h存在明顯的轉折點，與圖2中pH值的急速下降處于同一時期，說明水解產物的迅速積累導致微生物反應受到抑制，致使厭氧消化產氣效率下降；在高負荷反應進行到22 h，累積產氣量分別達到68.8 mL/g(VS)和49.7 mL/g(VS)后，系統(tǒng)幾乎停止產氣，甲烷產率在反應開始12 h后始終非常低，實驗結束時的累積產甲烷量分別為6.0 mL/g(VS)和4.7 mL/g(VS)，只達到總產氣量的12.73%。曹秀芹等[18]在餐廚垃圾中溫單相有機負荷梯度實驗中發(fā)現(xiàn)，容積沼氣產率在第48 d降低至1.88 L/(L·d)時系統(tǒng)失穩(wěn)。韓國然[19]在中溫批式反應中發(fā)現(xiàn)以累積產甲烷量作為酸化失穩(wěn)預警指標時，系統(tǒng)在30 h左右發(fā)生酸化。在不同體系中，因接種泥與進料來源的不同，產氣量所對應的體系酸化情況也不盡相同，難以得出普適于不同工況的系統(tǒng)酸敗判斷法。此外，將圖2與圖3對比，發(fā)現(xiàn)pH值的急速下降期與累積產氣量的轉折點幾乎同時開始，反映出產氣量對系統(tǒng)酸敗失穩(wěn)的預警作用也相對滯后。

2.3 VFA質量濃度及其異構體變化

C4及以下的揮發(fā)性有機酸和乙醇在本文中統(tǒng)稱為VFA，是大分子有機物經水解為單糖、氨基酸等小分子后再經產酸階段的產物，也是產甲烷階段的主要底物。厭氧消化系統(tǒng)中穩(wěn)定的VFA質量濃度可以體現(xiàn)水解、產酸和產甲烷代謝反應速率之間的平衡[20]。因此，VFA質量濃度的突然變化及變化趨勢通常被用于預測厭氧過程的穩(wěn)定性[21]。本文實驗中，不同負荷比下的乙醇產量和VFAs的轉化率如表1所示。可以看出，高負荷下體系的乙醇產量和VFAs轉化率提高。

表1 不同負荷下乙醇產量和VFAs的轉化率

高負荷下體系的乙醇和VFAs產生情況如圖4所示。由圖4(a)和4(b)可以看出，在反應末期系統(tǒng)乙酸質量濃度可達到4 442 mg/L，丁酸質量濃度可達5 199 mg/L。因此，可判斷出高負荷下的厭氧消化類型為混合消化，以乙酸和丁酸為主，并伴隨有少量的乙醇、丙酸產生。黃小英[22]以VFA質量濃度超出13 000 mg/L時作為失穩(wěn)標志，曹秀芹等[18]則以2 500 mg/L作為閥值。在本文實驗中，在距反應開始大約22 h時發(fā)現(xiàn)pH值明顯下降，產氣受到嚴重抑制，甲烷產量幾乎為零，此時VFA質量濃度超過10 000 mg/L，因此單純以VFA質量濃度值作為失穩(wěn)指標不具有普遍性。

丙酸由于其代謝時間較長，在體系中的留存時間比較久，對系統(tǒng)環(huán)境變化較為敏感。研究表明，丙酸/乙酸質量濃度比可作為厭氧消化系統(tǒng)的預警指標：當丙酸/乙酸質量濃度比大于1.4時，認為系統(tǒng)即將酸化失穩(wěn)[23]。圖4(c)及(d)中，丙酸/乙酸質量濃度比始終小于1.4，然而兩個高負荷系統(tǒng)已經明顯發(fā)生酸敗。F/M=3的體系在第16 h達到最高峰0.16，F(xiàn)/M=4在第8 h達到0.15，這兩個時間點分別為各自的產氣上升期與產氣高峰期，系統(tǒng)運行正常。因此，限于體系底物與運行條件的不同，以VFA作為酸化失穩(wěn)指標存在較多局限性。

2.4 EPS成分變化

圖5所示為本文EPS中多糖(PS)和蛋白質(PN)隨反應進程的變化趨勢。如圖5(a)所示，EPS中多糖質量濃度呈現(xiàn)先大幅增長后下降，再小幅增長后持續(xù)下降的趨勢。F/M=3體系EPS中多糖質量濃度在第10 h出現(xiàn)第一個峰值，達到最高值1.01 mg/mL，第二個峰值出現(xiàn)在第25 h，為0.75 mg/mL。F/M=4體系EPS中多糖質量濃度在第10 h出現(xiàn)第一個峰值，達到最高值0.99 mg/mL，第二個峰值出現(xiàn)在第24 h，為0.74 mg/mL，變化規(guī)律很接近。在實驗末期，F(xiàn)/M=4體系的EPS中多糖質量濃度降得更低，達到0.5 mg/mL。EPS中多糖具有一定的生物降解性，可作為碳源物質被利用[24]。前10 h，在厭氧體系啟動后由于微生物處于活躍狀態(tài)，微生物對碳的利用率較高，因此胞外聚合物中的多糖質量濃度會隨之增加，之后系統(tǒng)開始大量產氣消耗碳源，多糖質量濃度隨之下降[12]。第24 h后，隨著體系中VFA的大量積累，尤其是乙酸和丁酸，系統(tǒng)產氣幾乎停滯，pH值迅速下降，多糖質量濃度下降明顯。

EPS中蛋白質質量濃度變化如圖5(b)所示。兩組高負荷體系中蛋白質的濃度一直存在上下浮動，但總體呈上升趨勢，這與許之揚等[11]的研究結果相似，說明厭氧消化中蛋白質比多糖更難被降解。F/M=4體系上升趨勢更為明顯，從第16 h至第20 h出現(xiàn)明顯增長，對應的此時間段pH值下降速率最大，產氣率明顯減小，系統(tǒng)失穩(wěn)。蛋白質本身含有疏水空腔，當乙酸濃度較高，細胞生命活動受影響時，疏水空腔能在一定程度上阻止乙酸的滲入，所以胞外聚合物中蛋白質質量濃度的提高可能是微生物主動適應高乙酸濃度環(huán)境的結果。王浩宇等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，當微生物處于不利環(huán)境時會分泌大量的酶蛋白物質，從而使得胞外蛋白增加，進而提高蛋白質與多糖比值。在本文中，隨著乙酸濃度不斷上升，蛋白質質量濃度呈現(xiàn)波動式上升。該現(xiàn)象可能是由于微生物在環(huán)境惡化情況下的自我保護反應或是更多的微生物隨著環(huán)境惡化而凋亡導致。F/M=3體系相對于F/M=4體系蛋白質質量濃度明顯偏低，蛋白質增長速率也更為平緩，與此對應的VFA質量濃度值也相對較低，pH值較高，產氣也相對較多，F(xiàn)/M=0.5體系蛋白質濃度則一直處于較低水平。以上結果再一次證明了微生物在厭氧消化過程中對于環(huán)境惡化的響應作用。

EPS中蛋白質與多糖質量濃度比值(ρPN/ρPS)變化如圖5(c)所示。F/M=4體系與F/M=3兩個體系的ρPN/ρPS變化趨勢基本一致，各自經歷了兩次小幅下降，又大幅度上升。兩個體系的ρPN/ρPS經歷了短暫的下降后，分別在第12 h和第10 h開始上升，并且在第18～20 h增幅最快，其中F/M=4體系的ρPN/ρPS在第18～20 h增幅達到18.78%。Adav等[26]認為好氧顆粒污泥中EPS的ρPN/ρPS正常范圍是3.4～6.2。本文實驗在第18 hρPN/ρPS超過6.2，在第20 h兩體系同時達到第一個峰值，分別為7.01和8.03，證明了體系開始出現(xiàn)惡化。與此同時，在比值上升并達到峰值的階段，兩個體系pH值迅速降到6以下(圖2)；產氣速率也迅速下降，產甲烷過程受到抑制(圖3)。第26 h后ρPN/ρPS持續(xù)上升，F(xiàn)/M=3體系最高達到8.0，F(xiàn)/M=4體系達到10.4，之后系統(tǒng)產氣停止，徹底酸化。而F/M=0.5體系由于負荷較低，體系產酸與產甲烷代謝平衡，EPS中的多糖和蛋白質質量濃度相對穩(wěn)定，ρPN/ρPS處于穩(wěn)定波動狀態(tài)。因此，根據ρPN/ρPS值的變化可以說明第18～20 h微生物體系徹底酸敗。

為了準確比較幾種指標對體系酸化的預警作用，本文比較了pH值、產氣量、乙醇和VFA產生量及ρPN/ρPS的相對變化量隨反應時間的變化情況(圖6)。pH值、產氣量、乙醇和VFA產生量變化在20 h以后趨于平緩，這些指標預警酸化的時間均大于20 h。而ρPN/ρPS值在18～20 h處達到峰值，該峰值可以指示微生物系統(tǒng)的EPS狀態(tài)變化，從而實現(xiàn)提前預警。因此，與傳統(tǒng)的pH值、產氣量、乙醇和VFA產生量等指標相比，ρPN/ρPS值可以提前、直觀地預警酸化。

3 結論

(1)研究了模擬餐廚垃圾厭氧消化過程中pH值、產氣量、VFA質量濃度及EPS成分隨反應時間的變化情況。在F/M=3與F/M=4兩種高負荷體系下，傳統(tǒng)指標pH值、單位VS產氣量及VFA的預警時間分別為26、24 h及22 h。3種指標受實驗體系差異的影響較大，均不能單一作為體系酸化失穩(wěn)的有效衡量指標。

(2)進一步研究表明，EPS成分在體系酸化前后變化，ρPN/ρPS值整體趨勢持續(xù)上升，直至系統(tǒng)徹底酸化。以蛋白質與多糖質量濃度比作為酸化預警指標大約能在第18～20 h做出預警，比其他常用指標提前約5 h，可作為酸化預警的有效指標。