明黨參內(nèi)生菌對(duì)苯磺隆的生物降解作用

葉曉婉 張桂麗 戚賀飛

關(guān)鍵詞：明黨參;內(nèi)生菌;苯磺隆;降解率;生物學(xué)鑒定

明黨參（Changium smyrnioides Wolff）為我國特有的傘形科明黨參屬植物，別稱山花、山蘿卜、明參、明黨[1]。明黨參是草本植物，周圍易雜草叢生，雜草與明黨參植株競(jìng)爭(zhēng)土壤中的營養(yǎng)成分，從而影響植株的生長發(fā)育，而磺酰脲類除草劑，如苯磺隆，能夠有效去除其周圍雜草，使明黨參旺盛生長。

苯磺隆（tribenuron-methyl，TBM），別稱麥樂樂、苯磺隆、巨星（杜邦）、億力、闊葉凈、麥磺隆等，是20世紀(jì)80年代由美國杜邦公司開發(fā)的一種內(nèi)吸傳導(dǎo)型磺酰脲類麥田除草劑[2-5]，主要用于防除各種一年生闊葉雜草。苯磺隆在我國長江、黃河和淮河流域有著廣泛的使用范圍。苯磺隆的大量使用，給土壤、水體、生物及大氣等諸多環(huán)境因子造成大量污染，影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)平衡[6-8]。因此，解決苯磺隆的殘留問題對(duì)改善除草劑對(duì)作物的藥害，修復(fù)受除草劑污染的土地有重要的理論意義和實(shí)際價(jià)值。而在生態(tài)系統(tǒng)中，作為分解者的微生物，代謝類型多樣，適應(yīng)環(huán)境的能力極強(qiáng)，能利用各種人工合成的農(nóng)藥作為碳、氮源生長，并將其完全降解成無機(jī)物[9]。田爽等篩選出4株能以苯磺隆為唯一碳源生長的降解菌，并對(duì)其生理生化特性進(jìn)行研究[9]。Zhang等篩選出一株苯磺隆降解菌，經(jīng)初步鑒定為假單胞桿菌，根據(jù)所查資料，國外尚未見有關(guān)于降解苯磺隆菌株的研究報(bào)道[10]。本試驗(yàn)從明黨參內(nèi)生菌著手，進(jìn)行一系列的研究，旨在從中篩選出能夠高效降解苯磺隆的明黨參內(nèi)生菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽培養(yǎng)基（inorganic salt medium，IS）：磷酸二氫鉀（3.0 g/L）、七水硫酸鎂（0.1 g/L）、硝酸銨（2.0 g/L）、磷酸氫二鉀（1.5 g/L）、無水氯化鈣（0.01 g/L）、乙二胺四乙酸二鈉（0.01 g/L），pH值7.5±0.1，25 ℃。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar，NA）：牛肉浸粉（3.0 g/L）、蛋白胨（10.0 g/L）、氯化鈉（5.0 g/L）、瓊脂粉（15.0 g/L），pH值7.3±0.1，25 ℃。

1.1.2 試驗(yàn)樣品與試劑 試驗(yàn)樣品明黨參產(chǎn)自河南省鄭州市某中草藥試驗(yàn)田。試驗(yàn)試劑：苯磺隆（純度95%）由中國沈陽化工研究所提供;甲醇（色譜純）由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn);乙腈（色譜純）由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試驗(yàn)儀器和設(shè)備 一次性無菌進(jìn)樣器（1 mL）：江蘇華達(dá)醫(yī)療器材有限公司生產(chǎn);紫外可見分光光度計(jì)（UV2600）：日本島津儀器有限公司生產(chǎn);高效液相色譜儀（Agilent 1200）：安捷倫科技有限公司生產(chǎn);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Allegra 64R）：美國貝克曼庫爾特有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 明黨參內(nèi)生菌的分離 取明黨參的根、莖、葉等組織部位，將組織表面的泥土等雜質(zhì)用自來水沖洗之后在干凈的自來水中浸泡1 h;然后移入無菌超凈工作臺(tái)，用無菌水再次沖洗3次之后用無菌濾紙吸干表面的水分。采用“75%乙醇-2.5%次氯酸鈉-75%乙醇”三步表面消毒法將各組織消毒，其中根組織用75%乙醇浸泡3 min，2.5%次氯酸鈉浸泡7 min，75%乙醇浸泡20 min;莖組織用75%乙醇浸泡3 min，2.5%次氯酸鈉浸泡5 min，75%乙醇浸泡18 min;葉組織用75%乙醇浸泡 2 min，2.5%次氯酸鈉浸泡3 min，75%乙醇浸泡 15 min。表面消毒過的明黨參組織，分別用無菌水沖洗6次后用無菌濾紙吸干表面的水分。之后用滅菌的鑷子、剪刀、無菌刀片將明黨參的根與葉組織剪切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，莖組織剪切成長度約為0.5 cm的組織。在NA、PDA、高氏一號(hào)培養(yǎng)基的平板上，分別等距接種4個(gè)根、莖、葉組織塊，每個(gè)處理重復(fù)3次。將平板依次放置到37、28、30 ℃培養(yǎng)箱中，觀察平板中組織邊緣菌落生長狀況。

對(duì)照組：采用組織印跡法，將以上經(jīng)過消毒處理的根、莖、葉組織放入NA、PDA、高氏一號(hào)培養(yǎng)基中，使滅菌材料表面與培養(yǎng)基接觸20 min后移走明黨參各組織塊，并將培養(yǎng)基置于相同條件下培養(yǎng)相同時(shí)間，觀察平板是否有肉眼可見的菌落長出。

1.2.2 明黨參內(nèi)生細(xì)菌的純化與保藏 待平板中組織塊邊緣長出可以用肉眼觀察到的菌落后，用接種環(huán)挑取少許邊緣菌落接種到新的NA培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，待菌落生長后重復(fù)此操作6次以上進(jìn)行純化，直到得到單一的純菌落。定期觀察，挑選優(yōu)勢(shì)單菌落劃線純化后甘油保藏備用。

1.2.3 苯磺隆降解菌的篩選 （1）初篩。將以上分離得到的明黨參內(nèi)生菌接種在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，再轉(zhuǎn)接到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)12 h。配制無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基，121 ℃、0.1 MPa 下滅菌15 min。在超凈工作臺(tái)中，向無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入等量的濃度為10%的苯磺隆溶液，倒平板，冷卻。分別取1 mL菌液接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基，無菌環(huán)境下涂布，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。將得到的菌株接入NB培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)1 d，向100 mL無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加入濃度為10%的苯磺隆溶液1 mL，取1 mL NB培養(yǎng)基中的菌液接種于無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣，于D600 nm測(cè)定菌株的生長情況，重復(fù)多次。（2）復(fù)篩。配制150 mL的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，121 ℃、0.1 MPa下滅菌15 min。在超凈工作臺(tái)中，向培養(yǎng)基加入苯磺隆標(biāo)準(zhǔn)品0.45 g，搖勻混合。將初篩得到的菌液接種于此，37 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)，定時(shí)觀察無機(jī)鹽培養(yǎng)基的清晰程度，并定時(shí)取樣，于D600 nm測(cè)定菌株的生長情況，重復(fù)多次。

2.4.2 降解菌的16S rDNA基因序列同源性分析 經(jīng)過PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳、純化回收DNA目的條帶、PCR引物測(cè)序，菌株P(guān)MG3的16S rDNA基因序列全長為1 418 bp。選取與內(nèi)生菌菌株同源性較高的10株菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果見圖4。通過BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果表明，菌株P(guān)MG3與Bacterium wsb-1和Bacillus tequilensis stain Y11進(jìn)化距離較近;結(jié)合菌株形態(tài)特征、生化特性、微生物質(zhì)譜鑒定結(jié)果和16S rDNA基因序列同源性分析，初步鑒定菌株P(guān)MG3為芽孢桿菌屬（Bacillus sp. PMG3）。

2.4.3 降解菌的質(zhì)譜分析 本試驗(yàn)所用的質(zhì)譜儀基本原理是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)[11]，根據(jù)離子的質(zhì)荷比與離子的飛行時(shí)間成正比，檢測(cè)樣品到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間即可檢測(cè)離子，對(duì)樣品進(jìn)行分析，通過與數(shù)據(jù)庫信息比對(duì)，篩選并確定相應(yīng)圖譜，進(jìn)而得到鑒定結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同細(xì)菌屬、種的鑒定。菌株P(guān)MG3的質(zhì)譜圖譜如圖5所示，菌株P(guān)MG3在4 307.89 m/z附近離子流強(qiáng)度最大， 其峰高為1 600， 峰面積為2 789 635，信噪比為28，分辨率為753。菌株P(guān)MG3經(jīng)檢索后與數(shù)據(jù)庫中枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的匹配分值為9.115，菌株P(guān)MG3鑒定為芽孢桿菌屬。

3 討論與結(jié)論

苯磺隆是一種乙酰羥基酸合成酶（AHAs）抑制除草劑[12]。AHAs又稱乙酰乳酸合酶，催化支鏈氨基酸合成途徑的第一步，包括纈草堿、亮氨酸和異亮氨酸[13-14]。苯磺隆通過將AHAs活性位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)殡y以與底物結(jié)合的構(gòu)象來抑制雜草。目前，國內(nèi)外關(guān)于苯磺隆的研究主要集中在藥理、殘留分析方法及其對(duì)植物生理特性的影響等方面[6-7，15-23]。雖然在苯磺隆的篩選、鑒定等方面已有一些文獻(xiàn)報(bào)道，如田爽等篩選出4株能降解苯磺隆的菌株[9]。Zhang等篩選出2株苯磺隆降解菌，但很少涉及苯磺隆降解試驗(yàn)及降解率指標(biāo)，所報(bào)道降解菌的降解效率不明晰，且菌源多為土壤[10]。杜迅等的試驗(yàn)菌源來自河南省臨潁縣麥田[24]，田爽等的試驗(yàn)菌源來自受農(nóng)藥苯磺隆污染的土壤[9]。

本研究首次以中草藥明黨參為菌源材料，分離得到了1株能夠高效降解苯磺?。ń到饴式咏?89.07%）的內(nèi)生菌，并對(duì)能高效降解苯磺隆的明黨參內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行生物學(xué)鑒定，根據(jù)16S rDNA基因序列同源性分析以及質(zhì)譜結(jié)果確定屬于芽孢桿菌屬，這與已有文獻(xiàn)多數(shù)報(bào)道的降解菌不同，豐富了苯磺隆降解菌資源庫，對(duì)于修復(fù)受苯磺隆污染的農(nóng)田有著重要意義，也為中草藥內(nèi)生菌資源利用及農(nóng)藥生物降解菌的篩選開辟了新途徑。

苯磺隆作為磺酰脲類除草劑的一員，沸點(diǎn)較低，并且國內(nèi)外對(duì)其報(bào)道都相對(duì)較少，再加上試驗(yàn)條件和試驗(yàn)時(shí)間所迫，本研究還存在一定的不足。今后可以在苯磺隆的降解條件、降解機(jī)理等方面進(jìn)行探討和研究，為中草藥內(nèi)生菌降解苯磺隆提供理論依據(jù)。

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