PEG模擬干旱脅迫對(duì)大葉醉魚草種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響

李新蕾 李葉芳 關(guān)文靈

關(guān)鍵詞：大葉醉魚草;干旱脅迫;種子萌發(fā);幼苗生長(zhǎng);抗逆生理指標(biāo);抗旱性

世界上有1/3以上的土地處于干旱和半干旱地區(qū)[1]。我國(guó)現(xiàn)有干旱區(qū)面積占國(guó)土總面積的383%[2-3]。干旱是影響植物分布和生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因子之一，其危害程度在諸多非生物脅迫中占首位[4]。研究植物干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制、評(píng)價(jià)其抗旱性，將為提高植物水分利用效率、提高植物抗旱性能、選育抗旱優(yōu)良品種、發(fā)展高產(chǎn)耐旱農(nóng)業(yè)提供理論指導(dǎo)，同時(shí)選擇適生植被對(duì)受損生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行植被修復(fù)、恢復(fù)和人工生態(tài)系統(tǒng)的建立是非常有效的環(huán)境治理途徑[5]。

在干旱環(huán)境下，種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)階段是決定植物能否正常生長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期，而耐旱性較好的植物，其種子在缺水環(huán)境下常常會(huì)形成特殊的萌發(fā)機(jī)制以確保萌發(fā)與繁衍。同時(shí)干旱脅迫可引起植物幼苗失水，誘發(fā)滲透脅迫及活性氧損傷。為了保持體內(nèi)的水分平衡，使細(xì)胞發(fā)揮正常功能，抵御干旱脅迫傷害，植物的細(xì)胞液滲透勢(shì)會(huì)降低，氣孔關(guān)閉推遲，同時(shí)酶促系統(tǒng)中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）等的合成活動(dòng)增強(qiáng)[6-8]。聚乙二醇（PEG）作為一種滲透調(diào)節(jié)劑，能較為理想地模擬干旱環(huán)境，具有簡(jiǎn)便快速、重復(fù)性好、周期短等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于種子和幼苗干旱脅迫等相關(guān)試驗(yàn)中，并在園林植物羅布麻[9]、小雀花[10]、玉帶草[11]等種子種苗的抗旱特性方面取得了較好的研究成果。

大葉醉魚草是醉魚草屬（Buddleja L.）植物中具有很高觀賞價(jià)值的種類，既可作為庭園觀賞植物，也是很好的生態(tài)修復(fù)植物。目前，在歐洲引種栽培的醉魚草屬品種已超過120個(gè)，是歐美園林植物中最流行的觀賞灌木之一。我國(guó)雖有豐富的醉魚草屬種質(zhì)資源，但還沒有進(jìn)行系統(tǒng)的發(fā)掘利用[12]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)大葉醉魚草的研究主要集中在其藥用成分及殺蟲成分上，關(guān)于其抗性的研究較少，且主要研究其對(duì)重金屬的耐性。本試驗(yàn)以大葉醉魚草為材料，通過PEG-6000人工模擬不同程度的干旱脅迫，研究干旱脅迫對(duì)大葉醉魚草種子萌發(fā)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶系統(tǒng)等生理生化特性的影響，以期明確大葉醉魚草種子及幼苗對(duì)干旱環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，為大葉醉魚草在園林及在生態(tài)修復(fù)中的應(yīng)用提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用大葉醉魚草種子于2018年5—6月采自云南省昆明市，采集后保存于4 ℃冰箱中。2018年5—8月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行PEG-6000模擬干旱脅迫下種子萌發(fā)試驗(yàn)。2018年6月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行播種育苗，2018年9月移至云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行PEG-6000模擬干旱脅迫下幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 種子萌發(fā)試驗(yàn) 選取大小均勻的優(yōu)質(zhì)大葉醉魚草種子，先用1%體積分?jǐn)?shù)的次氯酸鈉浸泡消毒30 min，再用蒸餾水沖洗直至無次氯酸鈉后待用。以培養(yǎng)皿（直徑 9 cm，內(nèi)鋪有濾紙）作為發(fā)芽床，將供試種子均勻排布在加有等量、質(zhì)量分?jǐn)?shù)（下同）分別為0（蒸餾水，CK）、5%、10%、15%、20%、25%的PEG-6000水溶液的發(fā)芽床中，每床50粒，置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)測(cè)定，培養(yǎng)溫度為25 ℃、光照時(shí)間為12 h/d。每天向?yàn)V紙上加蒸餾水或PEG-6000水溶液以保持原始質(zhì)量，每處理重復(fù)3次。每天18：00觀察并記錄大葉醉魚草種子萌發(fā)情況，種子發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn)為種子露出胚根，連續(xù)3d種子發(fā)芽數(shù)不足供試種子數(shù)的1/100視為萌發(fā)結(jié)束，于 16 d 后結(jié)束試驗(yàn)。記錄發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間、發(fā)芽持續(xù)時(shí)間，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，最后計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)。計(jì)算方法或公式如下：

發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間：從發(fā)芽試驗(yàn)開始到第1粒種子開始萌發(fā)所需時(shí)間（d）;

發(fā)芽持續(xù)時(shí)間：第1粒種子開始萌發(fā)到萌發(fā)結(jié)束所需時(shí)間（d）;

發(fā)芽率（GR）=種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%;

發(fā)芽勢(shì)=規(guī)定時(shí)間內(nèi)發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù)×100%;

發(fā)芽指數(shù)（GI）=∑（在不同時(shí)間的發(fā)芽數(shù)/對(duì)應(yīng)的發(fā)芽所用時(shí)間）。

1.2.2 幼苗模擬干旱脅迫試驗(yàn) 將營(yíng)養(yǎng)土和珍珠砂按體積比3 ∶ 1配成基質(zhì)，等量分裝于塑料盆（16 cm×18 cm）中，每盆種4株幼苗，添加適量的蒸餾水后放入人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)。光照條件為白天12 h（25 ℃），夜晚12 h（15 ℃），進(jìn)行模擬干旱脅迫處理。根據(jù)種子萌發(fā)試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)置 PEG-6000 水溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%及對(duì)照（蒸餾水，CK），每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2盆。每天18：00用稱質(zhì)量法補(bǔ)充PEG-6000水溶液至原始質(zhì)量，分別于干旱脅迫處理后3、6、9 d，取幼苗葉片放入液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于測(cè)定幼苗葉片的各項(xiàng)生理指標(biāo)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

SOD活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）法測(cè)定，單位為U/g;過氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，以1 min內(nèi)D410 nm變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U）;CAT活性采用紫外吸收法測(cè)定，以1 min內(nèi)D240 nm減少0.1的酶量為1個(gè)酶活性單位（U）;丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，μg/g;脯氨酸（Pro）含量的測(cè)定采用酸性茚三酮法，μg/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，測(cè)定結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析，用Duncans法進(jìn)行單因素比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對(duì)大葉醉魚草種子萌發(fā)的影響

大葉醉魚草種子萌發(fā)進(jìn)程見圖1，可見對(duì)照組與5%、10%PEG脅迫處理的種子在培養(yǎng)4 d時(shí)開始啟動(dòng)發(fā)芽，5 d時(shí)大量萌發(fā)，平均萌發(fā)種子數(shù)分別為74、72、32粒;15%PEG脅迫處理種子到培養(yǎng)7 d時(shí)有個(gè)別重復(fù)啟動(dòng)發(fā)芽;20%及以上質(zhì)量分?jǐn)?shù)PEG脅迫處理下種子未見萌發(fā)。

同時(shí)，大葉醉魚草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)隨PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的加大而呈逐漸下降的趨勢(shì)（表1），且影響效應(yīng)隨PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同呈現(xiàn)出差異性。在發(fā)芽率方面，5%、10%PEG脅迫處理與對(duì)照比較差異不顯著，15%脅迫處理與對(duì)照間差異顯著（P<0.05）;在發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)方面，5%PEG脅迫處理與對(duì)照間差異不顯著，10%、15%PEG脅迫處理與對(duì)照比較差異顯著（P<0.05）;15%PEG脅迫處理下大葉醉魚草種子萌發(fā)的各項(xiàng)指標(biāo)急劇下降，與對(duì)照間差異均顯著（P<0.05），發(fā)芽率僅為對(duì)照的64.43%;在發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間方面，除15%PEG脅迫處理在培養(yǎng)7 d啟動(dòng)發(fā)芽外，0～15% PEG處理均在培養(yǎng)4 d開始發(fā)芽;PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%及以上時(shí)則已完全抑制了大葉醉魚草種子萌發(fā)，各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)全部為0。

2.1 干旱脅迫對(duì)大葉醉魚草幼苗葉片游離脯氨酸和丙二醛含量的影響

游離脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠參與植物細(xì)胞水勢(shì)的調(diào)節(jié)[13]。從圖2-A可以看出，大葉醉魚草幼苗中游離脯氨酸的含量隨著PEG脅迫濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)上升，并顯著高于同期對(duì)照（P<0.05）。其中10%、20%PEG脅迫處理游離脯氨酸含量上升速度較30%PEG脅迫處理慢，其間無明顯差異;30%PEG脅迫處理下游離脯氨酸含量上升幅度較大，在3、6、9 d時(shí)游離脯氨酸含量分別為177.29、239.75、273.821 μg/g，分別是同期對(duì)照組的2.29、2.635、2878倍。表明大葉醉魚草幼苗體內(nèi)會(huì)積累較多的脯氨酸來適應(yīng)干旱環(huán)境。

另外，干旱脅迫初期處理3 d時(shí)，大葉醉魚草幼苗MDA含量隨著脅迫溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而上升（圖2-B），但變化幅度較小，而各處理組與對(duì)照相比仍差異顯著（P<0.05）;在處理6、9 d時(shí)，10%、20%PEG脅迫處理幼苗MDA質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升不明顯，但與對(duì)照組相比仍差異顯著（P<0.05），30%PEG脅迫處理MDA含量持續(xù)升高，且幅度增大。結(jié)果表明，隨著干旱脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，大葉醉魚草幼苗可以抵抗一定程度的干旱脅迫誘導(dǎo)的膜質(zhì)過氧化作用傷害，且得到明顯緩和，但干旱脅迫程度過高仍會(huì)導(dǎo)致大葉醉魚草幼苗質(zhì)膜出現(xiàn)明顯損壞。

2.2 干旱脅迫對(duì)大葉醉魚草幼苗抗氧化酶活性的影響

超氧化物歧酶的主要功能是清除 O-2 ·，降低氧自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，其活性高低是評(píng)價(jià)植物抗旱性的重要指標(biāo)之一[14]。CAT通過與SOD起協(xié)同作用，將植物體內(nèi)的H2O2轉(zhuǎn)化成H2O，以保持體內(nèi)的活性氧在較低水平上[15]。隨著PEG模擬干旱脅迫程度的加強(qiáng)，各時(shí)期大葉醉魚草幼苗SOD活性均表現(xiàn)出逐漸升高的變化趨勢(shì)，且處理組始終顯著高于同期對(duì)照組（P<0.05）;隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理SOD活性基本呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，20% PEG脅迫處理6 d時(shí)，大葉醉魚草幼苗SOD活性為231.23 U/g，是同期對(duì)照組的1.47倍（圖3-A）。隨著PEG脅迫強(qiáng)度的增加，大葉醉魚草幼苗CAT活性呈逐漸上升的趨勢(shì);隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，大葉醉魚草幼苗CAT活性均表現(xiàn)出明顯的先上升后下降的趨勢(shì)，但各組均在處理6 d時(shí)具有最大值，30%PEG脅迫處理在在6 d時(shí)的CAT活性最強(qiáng)，達(dá)47.24 U/（g·min），為同期對(duì)照組的17.56倍（圖3-B）。在PEG模擬干旱脅迫處理下，大葉醉魚草幼苗POD活性的變化動(dòng)態(tài)與SOD、CAT稍有不同。干旱脅迫處理組的POD活性均顯著高于同期對(duì)照組（P<0.05），隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，各處理組均表現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，并在處理后3 d時(shí)出現(xiàn)最高活性，30%PEG脅迫處理在處理3 d時(shí)活性最強(qiáng)，達(dá) 98.03 U/（g·min），為同期對(duì)照的6.44倍（圖3-C）。表明大葉醉魚草幼苗在遭受干旱脅迫時(shí)，體內(nèi)抗氧化酶體系增強(qiáng)，能夠發(fā)揮清除活性氧的作用，以減輕過氧化傷害。

3 結(jié)論與討論

3.1 干旱脅迫對(duì)大葉醉魚草種子萌發(fā)的影響

干旱脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子之一，而植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)階段是對(duì)外界環(huán)境變化響應(yīng)最為敏感和脆弱的時(shí)期[16]。因此，通過模擬干旱環(huán)境來考察植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)情況，評(píng)價(jià)其應(yīng)對(duì)干旱脅迫的生理機(jī)制和抗逆性，具有較高的實(shí)際和理論價(jià)值。PEG-6000作為滲透調(diào)節(jié)劑，已廣泛應(yīng)用于不同植物的干旱環(huán)境模擬方面[6，17-18]。本試驗(yàn)通過對(duì)PEG-6000模擬干旱脅迫下大葉醉魚草種子萌發(fā)相關(guān)指標(biāo)及幼苗生理特性進(jìn)行分析，可以對(duì)大葉醉魚草種子和幼苗的抗旱性有初步的了解。

植物種子萌發(fā)指標(biāo)是反映其耐旱性能的最直接指標(biāo)，本研究結(jié)果表明，大葉醉魚草種子能在PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的干旱脅迫下正常萌發(fā)，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間與對(duì)照組間無顯著差異;10%PEG脅迫處理下大葉醉魚草的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)雖然顯著低于對(duì)照組（P<0.05），但發(fā)芽啟動(dòng)時(shí)間和最終發(fā)芽率與對(duì)照相比無顯著差異;在15%PEG脅迫下所有指標(biāo)均顯著低于對(duì)照組（P<0.05）;而當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，大葉醉魚草種子萌發(fā)受到強(qiáng)烈抑制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到25%時(shí)已完全致死。

3.2 干旱脅迫對(duì)大葉醉魚草幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和膜脂過氧化作用的影響

游離脯氨酸作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物響應(yīng)干旱脅迫時(shí)大量增加以發(fā)揮生理保護(hù)作用。植物體內(nèi)的脯氨酸會(huì)在其面對(duì)高溫和干旱等逆境脅迫時(shí)大量積累，其含量高低可以在一定程度上反映植物遭受干旱脅迫傷害的程度，大葉醉魚草遭受干旱脅迫時(shí)體內(nèi)會(huì)積累較多的脯氨酸，且脯氨酸含量與脅迫程度和時(shí)間呈正相關(guān)，表明大葉醉魚草幼苗隨著干旱脅迫強(qiáng)度的增加，其體內(nèi)需要產(chǎn)生大量的脯氨酸來應(yīng)對(duì)外界干旱脅迫，與眾多植物干旱脅迫研究的結(jié)果[19-20]一致。MDA能通過結(jié)合膜上的酶和蛋白質(zhì)而破壞質(zhì)膜的完整性，并導(dǎo)致選擇透性喪失，其含量高低可以反映植物受到干旱脅迫傷害程度的大小[21]。本研究中大葉醉魚草幼苗遭受干旱脅迫時(shí)，葉片MDA含量顯著增加，細(xì)胞膜出現(xiàn)損傷，膜透性降低;而隨著干旱脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，低濃度、中濃度PEG脅迫下的葉片MDA含量上升不明顯，高濃度PEG脅迫下MDA含量急劇上升，說明大葉醉魚草幼苗可通過生理調(diào)節(jié)作用調(diào)整生理機(jī)能以適應(yīng)一定程度的干旱環(huán)境，具有一定的抗干旱能力，然而PEG脅迫強(qiáng)度過大會(huì)導(dǎo)致大葉醉魚草幼苗細(xì)胞膜出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，加劇膜脂過氧化程度，導(dǎo)致生理劣變。

3.3 干旱脅迫對(duì)大葉醉魚草幼苗抗氧化酶活性的影響

SOD、 POD 和 CAT 普遍存在于植物體內(nèi)，是植物體內(nèi)的重要抗氧化酶，與植物的生理生化活動(dòng)關(guān)系密切。干旱或水分脅迫下，上述3種酶可協(xié)同起作用，有效清除活性氧及其他過氧化物自由基，緩解外在環(huán)境脅迫對(duì)植物造成的傷害[22-23]。本研究結(jié)果表明，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，大葉醉魚草幼苗的SOD、CAT活性均表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，POD活性則在脅迫初期就表現(xiàn)出最強(qiáng)的活性，與相關(guān)研究結(jié)果[23-24]一致，說明在遭受干旱脅迫時(shí)大葉醉魚草幼苗體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)能夠通過復(fù)雜的協(xié)同調(diào)控發(fā)揮減少活性氧累積的作用，但在嚴(yán)重干旱脅迫下活性氧的增加已超過抗氧化酶系統(tǒng)的負(fù)荷而對(duì)其造成傷害，從而引起酶活性的降低。此外，MDA的積累也會(huì)抑制SOD、POD的活性[25]，從而破壞了保護(hù)酶系統(tǒng)的功能，促使膜系統(tǒng)受損加重。

3.4 大葉醉魚草抗旱性的綜合評(píng)價(jià)

植物抗旱性是一個(gè)復(fù)雜的綜合性狀，它受多因素影響，而各因素之間又相互作用。綜上所述，大葉醉魚草種子具有一定的干旱耐受能力，在輕度干旱環(huán)境中可正常萌發(fā)，在中度、重度的干旱環(huán)境中仍有一定的種子萌發(fā)。同時(shí)，大葉醉魚草幼苗能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的游離脯氨酸和丙二醛含量來抵抗所處干旱環(huán)境的傷害，表現(xiàn)出較好的耐性。

大葉醉魚草是速生常綠灌木，其花期長(zhǎng)，花量多，具有較高的觀賞價(jià)值。在園林應(yīng)用中，可在其種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)階段給予一定的干旱脅迫以提升其抗旱能力。本研究結(jié)果可為揭示大葉醉魚草種子、幼苗適應(yīng)干旱環(huán)境的機(jī)制及今后大葉醉魚草的栽培應(yīng)用和抗性品種選育提供相關(guān)科學(xué)依據(jù)。

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