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    潮間帶大型海藻小珊瑚藻蛋白質(zhì)提取方法及雙向電泳體系優(yōu)化

    2020-06-21 15:35:06王小蓓王秀靜李麗霞
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2020年9期
    關(guān)鍵詞:雙向電泳提取方法蛋白質(zhì)

    王小蓓 王秀靜 李麗霞

    關(guān)鍵詞:小珊瑚藻;雙向電泳;蛋白質(zhì);提取方法

    蛋白質(zhì)組學是以細胞內(nèi)存在的全部蛋白質(zhì)及其活動規(guī)律為研究對象,是繼基因組學之后在分子水平上了解生命過程邏輯性的第2步,是后基因組時代生命科學研究的核心內(nèi)容之一。蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)主要包括雙向電泳技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)和生物信息學技術(shù)等,其中,雙向電泳技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學研究的有效技術(shù)[1-2]。與陸地高等植物相比,有關(guān)海洋藻類的蛋白質(zhì)組學研究相對滯后,但近年來該方面的研究日益興起。程華民等探討了2種不同方法提取珊瑚總蛋白質(zhì)的差異[3];王會芳等研究了龍須菜的蛋白質(zhì)提取條件及雙向電泳的優(yōu)化方案[4];Zou等研究了羊棲菜在重金屬銅脅迫條件下差異蛋白的變化特征等[5]。小珊瑚藻(Corallina pilulifera),隸屬于紅藻門小珊瑚藻科,藻體直立叢生,具鈣化特征,生活于中潮帶巖礁上或石沼內(nèi),全藻可供藥用。目前對其作用于赤潮微藻克生效應影響[6]、化學組成成分鑒定[7]、光合及鈣化作用等已有一些研究報道[8],但迄今對于小珊瑚藻的蛋白質(zhì)組學研究尚未見到相關(guān)報道。小珊瑚藻因其屬鈣化藻類,對海洋酸化有高敏感度,對小珊瑚藻蛋白質(zhì)的研究必將會為海藻蛋白質(zhì)的綜合開發(fā)利用提供更多的選擇[9]。

    海藻蛋白有多種不同提取方式,不同的藻類所適合的蛋白提取方式不同。本研究以具有代表性的潮間帶鈣化海藻小珊瑚藻為試驗材料,對常用的蛋白質(zhì)提取方法,包括飽和酚抽提法、三氯乙酸(TCA)-丙酮沉淀法、Trizol提取蛋白法、Biozol提取蛋白法、飽和硫酸銨沉淀法進行全面比較及探索優(yōu)化,篩選出蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)方法,并從膠條pH值和分離膠濃度研究探討雙向電泳系統(tǒng)的優(yōu)化方案,以期為潮間帶大型海藻小珊瑚藻逆境蛋白質(zhì)組學分析提供技術(shù)支撐,并為研究海洋紅藻門其他海藻尤其是珊瑚藻目海藻的蛋白質(zhì)組學研究提供重要參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    小珊瑚藻采集于山東省煙臺市月亮灣潮間帶,采樣后立刻用消毒海水反復沖洗以去除可見的附生物及沉積物。約30 g小珊瑚藻(鮮質(zhì)量)作為1個處理,培養(yǎng)于盛有3.5 L滅菌海水的玻璃缸中,玻璃缸直徑為20 cm。海水持續(xù)充氣并每日更換。經(jīng)過3 d的預培養(yǎng)后,取材進行蛋白質(zhì)的提取試驗。

    1.2 蛋白提取方法

    取小珊瑚藻適量,加入液氮研磨成粉狀,-80 ℃ 保存?zhèn)溆?。采用如?種方法來提取蛋白質(zhì)。

    1.2.1 飽和酚抽提法 飽和酚法基本參照Wang等的方法[10]并進行部分改進。

    向適宜小珊瑚藻細粉中加入8 mL 10% TCA丙酮提取液,4 ℃,15 000 r/min離心20 min,去除上清液;加入10 mL預冷丙酮重復上一步驟1次;冰上干燥。加入4 mL酚抽提液[30%蔗糖,0.25 mol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl),pH值為8.0,0.05 mol/L 乙二胺四乙酸二鈉,0.10 mol/L KCl,2%十二烷基硫酸鈉(SDS),0.02 mol/L二硫蘇糖醇(DTT)],混勻;加入4 mL Tris-丙酮-酚,在4 ℃條件下混勻1 h;4 ℃條件下,15 000 r/min離心 20 min,取上層酚層溶液于另一支15 mL離心管中,加入3倍體積的0.1 mol/L醋酸銨甲醇溶液,-20 ℃ 沉淀1 h;4 ℃ 下,15 000 r/min離心20 min取沉淀,加入 1 mL 丙酮(含0.02 mol/L DTT),4 ℃條件下,15 000 r/min 離心10 min,重復2次,收集沉淀;冷凍干燥,-20 ℃或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 TCA-丙酮沉淀法提取蛋白質(zhì) TCA-丙酮沉淀法基本參照Giavalisco等的方法[11]進行。

    取適量海藻細粉在15 mL離心管中,加入3~4倍預先配好的提取液A(10% TCA 5 g+0.07%巰基乙醇35 μL+丙酮50 mL),搖勻后,放入-20 ℃冰箱中靜置2 h,中間搖勻1次;4 ℃,12 000 r/min 離心30 min;棄上清液,加入提取液B(0.07% 巰基乙醇35 μL+丙酮50 mL),混勻,置于 -20 ℃ 冰箱中靜置2 h,中間搖勻1次,4 ℃,12 000 r/min離心,30 min;重復1~2次;棄上清,冷凍干燥,置于 -20 ℃ 或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 Trizol提取蛋白法 Trizol法參照Lee等的方法[12]并進行部分改進。

    向小珊瑚藻細粉中加入3 mL Trizol試劑,充分振蕩使其反應完全,超聲破碎5 min;在細胞勻漿中加入0.6 mL三氯甲烷,充分混勻;室溫放置2~3 min;4 ℃條件下,12 000 r/min離心10 min;小心吸取并丟棄上層液體,保留中間層及有機相,加入0.9 mL無水乙醇,顛倒充分混勻;4 ℃條件下,3 200 r/min 離心5 min;小心吸取上層有機相,加入4.5 mL異丙醇,輕輕振蕩后室溫放置10 min;4 ℃條件下,12 000 r/min離心10 min;棄上清液,取沉淀,用清洗液(乙醇)清洗沉淀2~3次,4 ℃ 條件下,7 500 r/min 離心5 min;冷凍干燥,置于 -20 ℃ 或-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 Biozol提取蛋白法 將Trizol提取蛋白法中的Trizol試劑替換成Biozol試劑,其他步驟同Trizol提取蛋白法。

    1.2.5 飽和硫酸銨沉淀法 飽和硫酸銨沉淀法基本參照葉翠芳等的方法[13]進行。

    取適量海藻細粉至4.5 mL離心管中,加入 2 mL 蛋白提取液(8 mol/L尿素,50 mmol/L維生素C,0.1 mol/L Tris,1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),1% β-巰基乙醇,0.5 mmol/L苯甲基磺酰氟,pH值為7.8),混合均勻后在4 ℃條件下存放過夜。4 ℃條件下,10 000 r/min離心20 min,去除沉淀,在冰浴條件下少量多次加入硫酸銨至飽和,4 ℃ 條件下存放12 h;4 ℃條件下,10 000 r/min離心20 min,棄上清液,取沉淀。向沉淀中加入 1.5 mL 裂解液,裂解液包含8 mol/L尿素、0.06 mol/L DTT、4% 3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(CHAPS)、0.04 mol/L Tris-HCl,pH值為8.8,并且使沉淀懸浮。4 ℃條件下,10 000 r/min 離心 20 min,去除沉淀,保留上清液。

    1.3 蛋白質(zhì)裂解及濃度測定

    將干燥的蛋白質(zhì)干粉溶于樣品裂解液[8 mol/L尿素、60 mmol/L DTT、4% CHAPS、40 mmol/L Tris-HCl、0.1%固相pH值梯度(IPG)緩沖液)],充分溶解蛋白質(zhì);室溫下12 000 r/min離心15 min,取上清液,并再次離心,充分去除雜質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度的測定采用Bradford法[14]。

    1.4 雙向電泳(two-dimensional electrophoresis,簡稱2-DE)

    等電聚焦電泳(IEF)過程采用預制IPG膠條(17 cm、pH值為4~7),按照等電聚焦儀器IPGphor等電聚焦系統(tǒng)設定程序進行;蛋白質(zhì)樣品取100 μL左右(根據(jù)濃度及染色方法而定),取220 μL左右制備好的水化上樣緩沖液(取出冷凍保存的水化液,室溫解凍后,加入DTT 0.5 mg/100 μL 及固相pH值梯度緩沖液 0.5 μL/100 μL),吹吸混勻。取出聚焦槽,均勻加入混有樣品的水化液,將膠條膠面朝下放入,被動吸收1 h;在膠條上覆蓋1.5 mL礦物油,將膠條槽轉(zhuǎn)移至IPGphor上,按表1中的參數(shù)進行聚焦。

    等電聚焦電泳過程結(jié)束后, 將膠條分別置于含1% DTT和2.5%碘乙酰胺的平衡液(6 mol/L尿素,0.5 mol/L Tris-HCl,pH值為8.8,2% SDS,20%甘油)中分別平衡15 min;轉(zhuǎn)移至分離膠濃度為 12.5%,厚度為1 mm的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠上端,進行垂直板電泳;電泳完成后,取下凝膠,采用硝酸銀染色法對凝膠進行染色。

    1.5 圖像掃描及分析

    凝膠脫色后立即用Image Scanner掃描儀進行掃描,分辨率為300 dpi。圖像采用PDQuest Advanced 8.0.1分析軟件進行分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 5種提取方法提取小珊瑚藻藻體總蛋白質(zhì)的電泳圖譜質(zhì)量比較

    本研究對常用的5種蛋白質(zhì)提取方法的雙向電泳圖譜效果進行橫向比較及質(zhì)量分析。由圖1可知,飽和硫酸銨沉淀法提取的小珊瑚藻蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜極不理想,有片狀蛋白陰影出現(xiàn),分離非常不徹底,雙向電泳效果極差(圖1-e)。Biozol提取蛋白法所得圖譜在酸性區(qū)出現(xiàn)大片空白,幾乎無蛋白質(zhì)點出現(xiàn),堿性區(qū)也只檢測到數(shù)量十分有限的蛋白點(圖1-d)。Trizol提取蛋白法可分離出標志性蛋白斑點,但蛋白質(zhì)點數(shù)較少,在堿性區(qū)有較多橫向條紋,影響蛋白質(zhì)的分布及觀察(圖1-c)。TCA-丙酮沉淀法所得到的圖譜分離效果較好,pH值分布范圍較為合理,較飽和硫酸銨沉淀法、Trizol及Biozol提取蛋白法等3種方法酸性區(qū)蛋白質(zhì)點明顯增多且清晰,但仍有較多縱向、橫向條紋(圖1-b)。飽和酚抽提法圖譜質(zhì)量最高,蛋白純度得到有效提升,在酸性區(qū)及堿性區(qū)聚焦均較好,能檢測到的蛋白質(zhì)點最多,且形狀規(guī)則,無明顯縱向、橫向條紋,可以達到理想的分離效果(圖1-a)。

    2.2 5種提取方法所得圖譜蛋白質(zhì)點數(shù)量差異比較

    5種提取方法所得小珊瑚藻電泳圖譜蛋白質(zhì)點數(shù)量見圖2-A。由圖可知,飽和硫酸銨沉淀法及Biozol提取蛋白法中損失了大量蛋白質(zhì),且雜質(zhì)干擾過多,分離出的蛋白質(zhì)點數(shù)量較少;Trizol提取蛋白法略好;TCA-丙酮沉淀法除雜效果較好,能檢測到482個蛋白質(zhì)點;相比上述方法,飽和酚抽提法使蛋白質(zhì)得到最為有效的分離,且蛋白質(zhì)中的雜質(zhì)去除效果較理想,檢測到的蛋白點數(shù)量為458。

    2.3 5種提取方法提取小珊瑚藻總蛋白質(zhì)濃度比較

    研究表明,用不同的提取蛋白質(zhì)方法所獲得的小珊瑚藻蛋白質(zhì)濃度不同(圖2-B),TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白質(zhì)濃度最大,其次為飽和酚抽提法,但其差異并未達到顯著水平(P>0.05),Trizol提取蛋白法、飽和硫酸銨沉淀法提取的蛋白質(zhì)濃度與TCA-丙酮沉淀法、飽和酚抽提法相比均達顯著水平(P<0.05),Biozol提取蛋白法提取的蛋白質(zhì)濃度與TCA-丙酮沉淀法、飽和酚抽提法相比,蛋白質(zhì)濃度差異達極顯著水平(P<0.01)。

    2.4 不同膠條pH值對蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)果的影響

    試驗設置2種不同pH值的膠條進行2-DE比對分析。膠條pH值為4~7時,蛋白點在圖譜上分布均勻,分離情況良好,結(jié)果見圖3-a;當膠條pH值為5~8時,由于酸性端pH值不足導致等電點較低的部分蛋白質(zhì)并未得到有效分離,蛋白質(zhì)點主要集中在左側(cè),且存在多點重疊現(xiàn)象,分離效果較差,僅得到189個蛋白質(zhì)點(圖3-b)。

    2.5 不同分離膠濃度對蛋白質(zhì)雙向電泳結(jié)果的影響

    研究2種不同的分離膠濃度對蛋白質(zhì)分離效果的影響,結(jié)果見圖4。當分離膠濃度為12.5%時,得到289個蛋白質(zhì)點,蛋白質(zhì)點形狀規(guī)則且分布情況良好(圖4-a);當分離膠濃度為10.5%時,僅得到93個蛋白質(zhì)點,蛋白質(zhì)點分布靠近圖譜邊緣,低分子量蛋白質(zhì)無法分離得到(圖4-b)。

    3 討論與結(jié)論

    蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一,海藻蛋白質(zhì)的開發(fā)利用是學者們研究的熱點領(lǐng)域。蛋白質(zhì)樣品的制備是雙向電泳成功的前提[15-17],采用不同方法提取的蛋白質(zhì)電泳效果會有顯著不同,尤其對于富含色素、多酚、多糖等次生代謝產(chǎn)物的海洋材料來說,其蛋白質(zhì)樣品的高效、高質(zhì)量制備顯得尤為困難。不同種類的海藻,其蛋白質(zhì)含量也有所不同。通常綠藻和紅藻蛋白含量高于褐藻,一般情況下紅藻的蛋白質(zhì)含量范圍為10%~47%[18-19]。

    海藻蛋白質(zhì)有多種提取方式,不同的藻類所適合的蛋白質(zhì)提取方式不盡相同,由于本研究的試驗材料小珊瑚藻具有明顯的鈣化特征[20],且藻紅素色素含量較高等特殊性質(zhì),因此,不能簡單借鑒其他海藻材料的某一種蛋白質(zhì)提取方法,有必要對常見的幾種蛋白質(zhì)提取方式同時進行綜合比較及改良優(yōu)化。趙宇鵬等比較了硫酸銨沉淀法、TCA/丙酮法及酚提取法對條斑紫菜葉狀體總蛋白的提取效果,發(fā)現(xiàn)酚提取法能有效去除雜質(zhì),得到最理想的電泳圖譜[21],本研究的試驗結(jié)果與之相似。

    Trizol法和Biozol法是提取植物中RNA的常用方法,也有學者將其創(chuàng)新性地用于蛋白質(zhì)的提取中[4,12]。苯酚、異硫氰酸胍是Trizol的主要成分,可使細胞裂解,蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)快速從細胞釋放。加入三氯甲烷后并離心后,溶液分為含有RNA的水相、含有DNA和蛋白質(zhì)的中間層和有機相。取出水相,用異丙醇可沉淀回收RNA,用乙醇沉淀可回收中間層DNA,用異丙醇沉淀可回收有機相中的蛋白質(zhì)并能夠去除蛋白質(zhì)中的水分。本研究中,Trizol提取蛋白法與Biozol提取蛋白法也可獲得小珊瑚藻蛋白質(zhì),但所提取的小珊瑚藻蛋白質(zhì)濃度及純度均不理想,且由于Trizol試劑與Biozol試劑價格因素,因此這2種提取方式不提倡使用。

    飽和硫酸銨沉淀法提取的小珊瑚藻蛋白質(zhì)測得的濃度雖然較高,但電泳圖譜出現(xiàn)大量蛋白陰影,只能得到個別蛋白斑點,說明所提取的蛋白質(zhì)純度很低,其原因可能是飽和硫酸銨沉淀法提取的小珊瑚藻蛋白質(zhì)所含鹽分及鈣質(zhì)過多,透析無法清除,因此對雙向電泳影響較大,該法不適合提取小珊瑚藻蛋白質(zhì)。

    由Bradford法測定的小珊瑚藻蛋白質(zhì)濃度和雙向電泳圖譜可知,飽和酚抽提法提取小珊瑚藻蛋白質(zhì)為最優(yōu)方法,蛋白質(zhì)分離良好,圖譜背景較為清晰,無明顯縱橫條紋,說明此方法提取的蛋白質(zhì)濃度高且純度較高。相比之下,TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白質(zhì)圖譜中縱橫條紋稍多,但其具備簡單方便的優(yōu)點,亦可作為小珊瑚藻蛋白質(zhì)提取方法的選擇之一。

    膠條pH值及SDS-PAGE分離膠的濃度是影響雙向電泳的結(jié)果的重要因素。膠條pH值范圍對蛋白質(zhì)的雙向電泳的分離效果會產(chǎn)生顯著影響,pH值范圍不合適導致蛋白質(zhì)有部分重疊,甚至會丟失某些蛋白質(zhì)。本研究結(jié)果表明,膠條pH值為4~7時,蛋白質(zhì)點在凝膠上分離情況較好,蛋白質(zhì)點分布均勻,蛋白質(zhì)點之間重疊較少且彼此之間界限明顯,從而可以分離得到更多的蛋白質(zhì)點,電泳分辨率得到較好提升,此結(jié)論與梁文裕等學者的研究結(jié)果[22-23]基本一致。

    不同的分離膠濃度使蛋白質(zhì)的分離效果亦有一定差異,須要根據(jù)實際情況選擇較為合適的分離膠濃度。本研究結(jié)果表明,分離膠濃度為12.5%時對小珊瑚藻的蛋白質(zhì)點分離效果優(yōu)于分離膠濃度為 10.5% 時。當分離膠濃度較低時,蛋白質(zhì)點的電泳位置靠近凝膠底端,較多低分子量的蛋白質(zhì)被丟失,從而在凝膠上不能顯示,這與王會芳等的研究結(jié)果[4]較為一致。因此,分離膠濃度為12.5%時更適合小珊瑚藻總蛋白雙向電泳的分離。

    綜上所述,本研究對小珊瑚藻總蛋白提取及 2-DE電泳條件進行了一系列優(yōu)化,建立了一套適合小珊瑚藻總蛋白的2-DE體系,為小珊瑚藻蛋白質(zhì)組的研究奠定了有效基礎,同時亦可為其他紅藻門大型海藻蛋白質(zhì)組學研究提供重要的參考依據(jù)。

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