基于整合藥理學平臺探究淫羊藿對高脂血癥的作用

李麗靜，錢 圳，周凱旋，張亞杰，于 澎，許天陽

（長春中醫(yī)藥大學，長春 130117）

高脂血癥是機體脂質(zhì)代謝異常而導致一種慢性代謝性性疾病嚴重威脅人們的健康[1]。目前，西醫(yī)常見的調(diào)血脂藥物預防和治療貢獻巨大，但其不良反應也不斷顯現(xiàn)[2]。近年來，中醫(yī)藥治療慢性病的優(yōu)勢不斷被報道[3]。中醫(yī)認為，高脂血癥的辨證主要認為是由于“肥甘厚味，多食少動，脾腎陽虛所致”[4-5]。淫羊藿始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[6]，藥理研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿含淫羊藿素、淫羊藿苷、多糖、生物堿、揮發(fā)油等化學成分對高脂血癥和其他心血管疾病的預防和治療有著較好的作用[7-9]。

整合藥理學平臺是以中醫(yī)藥大數(shù)據(jù)為基礎構建計算平臺[10-11]。因此，本研究借助整合藥理學的平臺，構建“中藥—化學成分—作用靶標—疾病靶標”[12]，分析并預測淫羊藿治療高脂血癥的作用靶點和可能參與的生物學途徑，并通過動物實驗觀察淫羊藿在治療高脂血癥方面的效果。

1 數(shù)據(jù)獲得

使用TCMIP V2.0平臺（http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）進行，該平臺中藥材數(shù)據(jù)來源于ETCM（http://www.ehbio.com/ETCM/）中醫(yī)百科全書數(shù)據(jù)庫，[13]。并設置了3種拓撲結構特征值包括：連接度（degree）、介度（betweenness）、緊密度（closeness），以確定中藥矯正疾病失衡網(wǎng)絡的候選靶標[14]。通過基因功能分析和通路富集分析，確定靶標基因生物學功能以及其所參與的生物學通路。

2 方法

2.1 藥物成分及靶標獲得 以“淫羊藿”作為關鍵詞進行檢索中藥材模塊，可獲得關于淫羊藿的化學成分以及對應的靶標。選擇相似性分數(shù)≥0.8 的藥物所對應的靶標為淫羊藿候選靶標[15]，使用平臺中的靶標富集分析功能，分析淫羊藿的生物學過程和作用途徑。

2.2 疾病靶標獲得 以“hyperlipidemia”為關鍵詞在“疾病靶標數(shù)據(jù)庫”中檢索，可以獲得該疾病相關的蛋白和基因。

2.3 藥物疾病分析 將所獲得藥物作用靶標與疾病靶標，使用TCMIP中蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫，構建蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡。

2.4 基因功能和通路富集分析 以“節(jié)點連接度（degree）”的2 倍中位數(shù)為卡值，選取中藥靶標—疾病基因互作網(wǎng)絡的核心節(jié)點；選取同時滿足節(jié)點連接度（degree），節(jié)點緊密度（closeness）和節(jié)點介度（betweenness） 的中位數(shù)的節(jié)點，作為淫羊藿治療高脂血癥的關鍵核心靶標，然后使用平臺中的靶標富集分析功能，分析淫羊藿治療高脂血癥的生物學過程和作用途徑。

2.5 實驗動物 SPF 級雄性Wistar 大鼠30 只，體質(zhì)量（180±15） g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，許可證號SCXK（遼）2015-0001，自由進水飲食，12 h 明暗交替照明，適應性普通飼料喂養(yǎng)1 周。

2.6 造模及給藥 大鼠隨機分為正常組、高脂模型組和淫羊藿治療組各10 只，正常組喂食普通飼料，模型組和治療組喂食高脂飼料，高脂喂養(yǎng)4 周后，治療組灌胃臨床等效劑量淫羊藿水煎液（1.6 g/kg），正常組和模型組灌胃蒸餾水，給藥4 周。

2.7 血脂檢測 大鼠麻醉后腹主動脈采血，靜置30 min 后，4 ℃轉速為3 000 r/min，離心10 min 取血清，按ELISA 試劑盒說明書檢測膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）含量。

2.8 肝臟病理變化 取大鼠肝臟稱量，計算肝臟的臟器指數(shù)，將肝臟組織放入4%甲醛溶液中固定，脫水、透明、石蠟包埋，制作5 μm 石蠟切片，按試劑盒進行HE 染色，于光鏡下觀察拍照。

3 結果

3.1 靶標收集結果 通過檢索數(shù)據(jù)庫，獲得淫羊藿成分27個，靶點170個，高血脂癥靶點46個，構建藥物—靶點—疾病網(wǎng)絡，獲得疾病與藥物之間直接共有靶點兩個過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）和微粒體甘油三酸酯轉運蛋白（MTTP）（圖1）。

3.2 核心靶標的獲得與分析 得到關鍵核心靶標23個，對核心靶標進行富集分析，取獲得生物學過程前二十（表1）。分析發(fā)現(xiàn)，淫羊藿可以影響蛋白質(zhì)的磷酸化、脂質(zhì)的代謝以及三羧酸循環(huán)等方面來達到治療高脂血癥的目的。

圖1 藥物—靶點—疾病網(wǎng)絡圖

表1 淫羊藿治療高血脂癥靶點GO 分析

對反應通路分析，在治療高脂血癥上，淫羊藿可能通過三羧酸循環(huán)通路、TP53 通路、G alpha (s)信號通路以及PI3K/AKT 等信號通路（表2）。

表2 淫羊藿治療高血脂癥靶點通路分析

3.4 大鼠血脂檢測結果 與正常組比較，模型組大鼠的TC和TG顯著升高（P＜0.01），表明高脂模型成立，給予淫羊藿治療后，高脂飲食大鼠的TC 和TG 濃度降低（P＜0.01，P＜0.05），見表3。

表3 淫羊藿對高脂飲食大鼠血脂影響（，n =10） mmol/L

表3 淫羊藿對高脂飲食大鼠血脂影響（，n =10） mmol/L

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3.5 大鼠肝臟病理變化 高脂飲食的大鼠肝臟臟器指數(shù)有所上升（P＜0.05），淫羊藿治療組的肝臟臟器指數(shù)與正常組差異不明顯（表4）。對肝臟進行HE 染色發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠肝臟細胞排列整齊，形狀規(guī)則，而模型組大鼠肝臟細胞排列松散雜亂，有較多空泡，而淫羊藿治療組情況有所改善（圖2）。

表4 淫羊藿對高脂飲食大鼠肝臟臟器指數(shù)影響（，n =10）

表4 淫羊藿對高脂飲食大鼠肝臟臟器指數(shù)影響（，n =10）

注：與正常組比較，# P ＜0.05

圖2 淫羊藿對高脂飲食大鼠肝臟病理變化的影響HE染色（×400）

4 討論

本研究通過整合藥理學建立中藥—靶點—疾病網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)PPARγ 和MTTP 是淫羊藿作用高血脂癥潛在的靶點，PPARγ 分布于能量代謝活躍的組織參與了脂肪細胞的分化、葡萄糖的攝取、脂肪酸代謝的調(diào)節(jié)[16]，實驗研究顯示，調(diào)節(jié)PPARγ 的表達對改善2 型糖尿病并發(fā)單純性脂肪肝具有良好作用[17]，而淫羊藿苷可以顯著上調(diào)肝臟內(nèi)的PPARγ 的表達，改善脂肪肝的病理變化[18]。同時，實驗顯示淫羊藿總黃酮在治療高脂血癥上，PPARγ 的表達也有一定的上調(diào)[19]。MTTP 是脂質(zhì)代謝中重要的脂質(zhì)轉運蛋白，它能夠加速三酰甘油、膽固醇的轉運和分解[20-21]。實驗研究表明，通過調(diào)節(jié)MTTP 的表達，對非酒精性脂肪肝進行治療，具有良好的效果[22]。因此淫羊藿可能通過影響PPARγ 和MTTP 的功能和表達來而影響機體的糖脂代謝。

三羧酸循環(huán)能夠調(diào)動囤積的脂肪使其轉化為葡萄糖，甘油和磷脂，后兩者進入三羧循環(huán)中，為機體供給能量[23]。TP53 的變異與代謝密切相關，并且可能會導致肥胖和2 型糖尿病的進一步發(fā)展[24]。同時，p53/p21 信號通路是衰老的核心調(diào)控通路，淫羊藿苷增強機體清除自由基能力和抑制脂質(zhì)過氧化可能與該通路有關[25]。Gα(s) 突變可以影響肝臟糖原分解，糖異生和葡糖糖的攝取與利用，并可進一步導致激素抵抗[26]。PI3K/Akt 通路與胰島素抵抗相關疾病如心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、肥胖等關系密切。因此表明淫羊藿可能參與以上生物學過程發(fā)揮治療高脂血癥的潛能[27]。

而后通過動物實驗進行驗證發(fā)現(xiàn)，在給予高脂飲食大鼠淫羊藿后，大鼠血清中的膽固醇和三酰甘油有所下降，并且大鼠的肝臟病理變化有所減輕，說明了淫羊藿對高脂飲食的大鼠脂肪肝的發(fā)生具有一定的改善作用，確定了淫羊藿在降脂方面應用的可能。

整合藥理學是根據(jù)數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)進行的理論推測，同時使用動物實驗進行推測的驗證，然而淫羊藿更多作用靶點和涉及的通路還有待進一步挖掘，本研究為實驗研究及臨床應用提供了一定的科學理論支撐。