抵當(dāng)湯對腦出血大鼠eIF2α、p-eIF2α及CHOP 蛋白表達的影響

單慧毓，張冬梅，盧 靖，王 健

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

腦出血是臨床上常見的腦血管疾病，具體是指顱內(nèi)血管破裂出血并在腦實質(zhì)內(nèi)形成血腫，其對神經(jīng)功能造成的損害是十分嚴重的。腦出血發(fā)病時間短、進展較快、病情危重，病死率高，且腦出血的病理過程比較復(fù)雜[1]。在腦出血病理過程中，神經(jīng)細胞的凋亡對人體的損害最為嚴重，而其中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress,ERS） 通路是目前學(xué)者們研究的熱點，ERS 通路參與了腦出血后神經(jīng)細胞凋亡的病理過程。近年來，不斷有學(xué)者證明，破血化瘀法對腦出血疾病的治療起到了良性調(diào)節(jié)的作用，其代表方抵當(dāng)湯治療效果顯著。劉軍瑩等[2]經(jīng)過大量的臨床數(shù)據(jù)整理分析，認為在治療急性腦出血中，抵當(dāng)湯加味聯(lián)合西藥組，其臨床效果優(yōu)于單純應(yīng)用西藥組，這種方法應(yīng)積極應(yīng)用于臨床腦出血的診治。本文研究觀察抵當(dāng)湯對大鼠腦出血后eIF2α、p-eIF2α 及CHOP 蛋白表達的影響，探討抵當(dāng)湯是否通過干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路而減輕細胞凋亡，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用，為抵當(dāng)湯治療腦出血提供實驗依據(jù)，進而為治療腦出血后神經(jīng)細胞凋亡引起的神經(jīng)損傷尋求潛在治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 研究對象為60 只健康的Wistar 大鼠，質(zhì)量240～300 g，平均為263.5 g，購買于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司。抵當(dāng)湯新綠色顆粒劑（生大黃5 g，水蛭5 g，桃仁15 g，虻蟲5 g），使1 mL藥液中含生藥1 g（四川新綠色顆粒藥業(yè)科技發(fā)展有限公司），采用傳統(tǒng)煎藥法，水煎液濃縮，4 ℃ 保存?zhèn)溆?。大鼠腦立體定位儀；手持式牙科鉆；電熱鼓風(fēng)干燥箱；酶標儀；臺式高速離心機；電子天平；微量進樣器；電泳儀；轉(zhuǎn)膜儀；勻漿器；一抗；二抗；緩沖液；裂解液；顯色液等。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作及給藥 參照徐氏等[3]方法造模。首先進行麻醉，向腹腔注射現(xiàn)配的10%的水合氯醛（350 mg/kg）。將大鼠俯臥位固定在立體定位儀上并進行調(diào)節(jié)，將大鼠門齒固定于門齒鉤上，使前、后囟基本在同一水平面上。消毒器具及大鼠頭部皮毛，沿正中線切開頭部皮膚，暴露冠狀縫及前后囟門。按照大鼠腦立體定位圖譜，設(shè)定前囟為 0 點，在0 點前0.4 mm，中線旁開3 mm 處做標記，用牙科鉆鉆開一個直徑約為1 mm 的小孔，達到硬腦膜表面，注意不要傷及硬腦膜及周圍腦組織。用事先準備好的40 ℃溫水仔細清洗大鼠尾部，并加熱，觀察鼠尾，待鼠尾充血后，用75%的乙醇消毒。提取尾動脈，用微量注射器取50 μL 的不抗凝動脈血，將動脈血注入尾狀核。傷口進行消毒縫合，均勻涂抹青霉素粉末以防止術(shù)后感染。假手術(shù)組操作過程同上，但不向尾狀核注入自體血，最后，將大鼠尾部用無菌紗布進行包扎、止血。術(shù)后人工排尿，清理會陰。正常對照組：自由飲食飲水。假手術(shù)組、模型組：生理鹽水灌胃，1 mL/100 g，每天1 次；抵當(dāng)湯低、中、高劑量組：0.13、0.26、0.52 mL/100 g 湯藥灌胃，每天1 次。以上大鼠均在麻醉清醒后（約術(shù)后3 h）給藥，直到喂藥到時間點宰殺，離斷頭顱，開顱，分離海馬，取患側(cè)大腦皮層。

1.2.2 大鼠神經(jīng)功能評分 等待大鼠清醒后，進行行為學(xué)分析，采用Longa 評分法[4]進行評價，0 分：大鼠無神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損癥狀；1 分：左前側(cè)肢體不能完全伸直；2 分：在大鼠行走時，出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈的行為；3 分：在大鼠行走過程中，出現(xiàn)向患側(cè)肢體的傾倒現(xiàn)象；4 分：不能自發(fā)獨立行走，大鼠出現(xiàn)意識喪失的現(xiàn)象。

1.2.3 Western Blot 法檢測eIF2α、p-eIF2α 及CHOP 的表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Graphpad Prism 5 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。采用t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，以Tukey’s multiple Comparison Test 進行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能評定

2.1.1 一般狀態(tài) 與假手術(shù)組大鼠比較，模型組大鼠進食量明顯減少，身體消瘦，一般狀態(tài)較差，毛色暗淡、無光。與模型組大鼠比較，抵當(dāng)湯低、中、高組大鼠在給藥3 d 后上述癥狀明顯改善。

2.1.2 神經(jīng)系統(tǒng)體征及神經(jīng)功能缺損評分 假手術(shù)組大鼠未見神經(jīng)功能缺損的體征，與假手術(shù)組大鼠比較，模型組大鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)系統(tǒng)病理體征，出現(xiàn)偏側(cè)肢體癱瘓，以前肢為重，行走時呈順時針追尾狀。與模型組大鼠比較，抵當(dāng)湯各組大鼠在給藥3 d 后上述癥狀明顯改善，到第7 天基本恢復(fù)正常，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分（）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分（）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01，### P ＜0.001

2.2 腦含水量測定 與假手術(shù)組大鼠比較，在損傷腦組織3 d 后，模型組大鼠腦區(qū)含水量明顯增加（P＜0.01）。在給藥第3 天后抵當(dāng)湯低、中、高級量組與模型組大鼠比較腦區(qū)含水量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 各組大鼠腦水腫含水量比較（）

表2 各組大鼠腦水腫含水量比較（）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與假手術(shù)組比較，△△P ＜0.01

2.3 各組大鼠eIF2α、P-eIF2α 及CHOP 蛋白表達比較 與假手術(shù)組比較，模型組的P-eIF2α 及CHOP 蛋白表達量升高（P＜0.01）；與模型組比較，抵當(dāng)湯組P-eIF2α 及CHOP 蛋白表達量降低，有顯著性差異。見圖1～圖3。

3 討論

圖1 各組大鼠腦組織eIF2α、P-eIF2α 及CHOP 免疫蛋白印跡（western blot）

圖2 各組大鼠腦組織CHOP 免疫蛋白表達

圖3 各組大鼠腦組織P-eIF2 α 免疫蛋白表達

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種膜性細胞器，主要與真核細胞中蛋白質(zhì)合成、折疊與分泌有關(guān)。大約有30%的細胞蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)過折疊、加工和修飾，形成有活性的功能性蛋白質(zhì)，如絕大多數(shù)分泌蛋白、整合膜蛋白及膜結(jié)合蛋白[5-7]。當(dāng)細胞出現(xiàn)缺血再灌注中損傷、氧化應(yīng)激損傷、鈣離子代謝紊亂及沉積、細胞能量的水平下降、異常的糖基化反應(yīng)等各種生理和病理因素時，便會產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，我們稱之為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷，這也是近年來分子生物學(xué)領(lǐng)域研究熱點之一[8]。ER 應(yīng)激是炎性疾病的主要原因[9]。ICH 后有原發(fā)性和繼發(fā)性的腦損傷，損傷導(dǎo)致細胞代謝受到損壞并且激活一系列應(yīng)激反應(yīng)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的 UPR[10]。一些報道表明，氧化應(yīng)激[11]，鈣離子超載[12]，離子紊亂[13]和毒性物質(zhì)的釋放[14]可能在各種疾病中誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進而引發(fā)細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會激活 PERK-eIF2α 信號通路，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成的持續(xù)減少，進而導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡和一些常見的臨床疾病[15-16]。在卒中模型中，PERK-eIF2α 蛋白的表達亦顯增高的趨勢[17]。CHOP 是一種細胞應(yīng)激的相關(guān)蛋白，也是ERS 過程中重要的中間信號分子[18]，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的時間過長或者強度過度過高時，ERS 會激活CHOP 信號通路，引起細胞凋亡。有研究者發(fā)現(xiàn)CHOP 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的直接靶點，CHOP 在NMDA 誘導(dǎo)的損傷的β 細胞中表達增加[19]。近年來，中醫(yī)藥學(xué)者經(jīng)不斷實驗研究，體外實驗證明了抵當(dāng)湯可通過阻斷IRE1 和PERK 信號通路，降低腦出血誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[20]。另有研究表明，在腦出血急性期，化瘀類中藥可以通過促進半暗帶腦水腫的吸收而減輕腦水腫，從而減輕細胞凋亡和促進血管內(nèi)皮的新生，在腦出血病理環(huán)節(jié)中發(fā)揮保護作用[21]。一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對早期腦損傷有治療作用，它可以通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而發(fā)揮對神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用[22]。

本實驗結(jié)果表明，抵當(dāng)湯可以通過下調(diào)eIF2α、p-eIF2α 及CHOP 蛋白的表達，抑制與細胞凋亡相關(guān)的信號通路的活化，從而抑制過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷，對腦出血半暗帶區(qū)的神經(jīng)細胞有保護作用，從而減輕凋亡。