杜仲黃酮對糖尿病腎病小鼠Nrf2/HO-1 氧化應(yīng)激信號通路的影響

許碧琪，戴燕青，傅倩云，梁 韜

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，杭州 310000；2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，南寧 530021）

糖尿病是導(dǎo)致終末期腎病發(fā)生的重要危險因素。糖尿病腎?。―N）是患者在長期慢性高血糖環(huán)境下出現(xiàn)的以腎小球濾過率異常和持續(xù)出現(xiàn)尿蛋白為特征的微血管并發(fā)癥[1]。目前多采用控制血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和鈣拮抗劑等綜合治療，但仍難以阻止腎功能的持續(xù)減退[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/HO-1 信號通路的激活可減少腎臟組織的氧化應(yīng)激，保護腎組織，延緩糖尿病腎病的進展[4]。杜仲黃酮為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）的干燥樹皮中提取的主要成分。有研究表明，杜仲及杜仲黃酮可降低糖尿病小鼠空腹血糖，并有良好的抗氧化作用[5-7]，但其具體的相關(guān)作用機制尚未清楚。因此，本研究基于前期預(yù)實驗結(jié)果，采用低濃度鏈脲佐菌素及高脂高糖誘導(dǎo)的糖尿病腎病小鼠體內(nèi)模型探討杜仲黃酮是否能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激信號通路Nrf2/HO-1 的表達來達到抗氧化作用，以期為糖尿病腎病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級，體質(zhì)量18～22 g 的昆明種雄性小鼠，購自浙江大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK（浙）2013-0023。小鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好的環(huán)境，室溫18～25 ℃，相對濕度40%～70%，12 h 光照晝夜循環(huán)。實驗開始前小鼠進行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.2 藥品與試劑 纈沙坦片（北京京豐制藥有限公司，批號：180113）；鏈脲佐菌素（美國Sigma 公司，批號：B1863）；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20181123）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20181030）；丙二醛（MDA）測試盒（南京建成生物工程研究所，批號：20181117）；預(yù)染蛋白Marker（西安潤德生物技術(shù)有限公司，批號：QE19514）；Nrf2、HO-1 蛋白抗體（武漢博士德有限公司，批號：2891904）；HRP 標(biāo)記的兔抗羊IgG 抗體（Santa Cruz Biotechnology，批號：CV20190425）；多克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology，批號：SC-1903）。

1.3 杜仲黃酮提取 采用醇提取法提取杜仲黃酮。首先將干燥杜仲進行充分粉碎，粉碎藥材置于容器中采用70%乙醇（藥材:70%乙醇=1:15），在80 ℃條件下加熱回流提取2 h，連續(xù)提取3 次。將提取液進行過濾濃縮，最后可獲得干燥杜仲黃酮提取物。

2 方法

2.1 糖尿病模型建立和給藥[8]取60 只昆明種雄性小鼠，鏈脲佐菌素采用冷藏枸櫞酸緩沖液現(xiàn)配現(xiàn)用，存放于冷藏避光環(huán)境中，低濃度鏈脲佐菌素（STZ）（40 mg/kg）尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，每天注射1 次，連續(xù)注射3 d。末次注射72 h 后檢測空腹血糖，以空腹血糖≥11.1 mmol/L 為糖尿病模型，將糖尿病模型小鼠繼續(xù)給藥高脂高糖飲食60 d 后，檢驗小鼠尿液，尿蛋白陽性小鼠視為糖尿病腎病模型成功。并另取10 只昆明小鼠作為空白對照。糖尿病腎病小鼠隨機分為模型對照組、纈沙坦對照組[20 mg/（kg·d）]、杜仲黃酮低、高劑量組[80、160 mg/（kg·d）]。各組小鼠灌胃給予相應(yīng)藥物，模型組和空白組小鼠給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥60 d。

2.2 指標(biāo)測定 末次給藥后2 h，檢測小鼠空腹血糖。并收集24 h 尿液，取其全血離心獲得血清標(biāo)本，摘取腎臟組織。血清及腎臟組織儲存于-80 ℃環(huán)境中。其中血清用于檢測小鼠腎功能指標(biāo)血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN），尿液用于檢測尿蛋白，腎功能指標(biāo)檢測采用全自動生化分析儀進行測定。部分腎臟組織進行勻漿，采用試劑盒檢測SOD 活性和MDA 含量，部分腎臟組織采用Western blotting 檢測Nrf2 和HO-1 蛋白表達情況。

2.3 Western blotting 檢測相關(guān)蛋白表達[9]向腎組織中加入RIPA裂解液，放入高通量組織研磨器中進行研磨，冰水上靜置1 h 后，4 ℃溫度下，以1.2×104r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min。取上清進行BCA 蛋白定量、煮蛋白。配制10% SDS-PAGE 凝膠，經(jīng)過上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，進行剪膜，加入特異性一抗，4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜后，加入與一抗對應(yīng)來源的二抗室溫慢搖1 h，再用TBST 洗，用ECL 發(fā)光液進行顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀曝光。Image J 進行灰度分析。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠血糖水平 結(jié)果見表1。

表1 杜仲黃酮對糖尿病腎病小鼠空腹血糖的影響

3.2 各組小鼠腎功能指標(biāo)變化 結(jié)果見表2。

表2 杜仲黃酮對糖尿病腎病小鼠血清腎功能指標(biāo)的影響

3.3 各組小鼠腎臟氧化應(yīng)激水平 結(jié)果見表3。

表3 杜仲黃酮對糖尿病腎病小鼠腎臟氧化應(yīng)激功能的影響

3.4 杜仲黃酮對各組小鼠腎組織中Nrf2、HO-1 蛋白表達的影響 結(jié)果見表4 和圖1。

表4 杜仲黃酮對糖尿病腎病小鼠Nrf2、HO-1蛋白表達的影響

圖1 杜仲黃酮對各組小鼠腎組織中Nrf2、HO-1蛋白表達的影響

4 討論

氧化失衡是糖尿病腎病的重要病理機制。在糖尿病患者長期高糖內(nèi)環(huán)境下，氧化應(yīng)激通過蛋白激酶C途徑和多元醇等途徑激發(fā)晚期糖基化終末產(chǎn)物的積聚，引起腎小球超濾過、系膜擴張、基底膜增厚和內(nèi)皮細胞紊亂，繼而誘發(fā)糖尿病腎病[10-11]。Nrf2 被稱為“多器官保護器”，其抗氧化反應(yīng)元件途徑激活可保護各細胞和組織器官免受氧化應(yīng)激的毒性損害[12-13]。

Nrf2 屬于堿性亮氨酸拉鏈家族中的一種核轉(zhuǎn)錄因子。廣泛存在于心臟、肺、肝、心肌和腎臟組織器官中。可通過誘導(dǎo)基因編碼抗氧化酶起到抗炎、抗氧化作用[14]。正常狀態(tài)下Nrf2 保持低轉(zhuǎn)錄水平，Nrf2 的活性依賴于鋅指樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）負性調(diào)節(jié)。在氧化應(yīng)激條件下，Keap1 結(jié)構(gòu)域中的半胱氨酸殘基被修飾進而構(gòu)象發(fā)生變化，促使Nrf2 的結(jié)合位點發(fā)生解聯(lián)，進而推動Nrf2與抗氧化元件（ARE）結(jié)合，激活靶基因，最后調(diào)控II 相解毒酶和抗氧化酶HO-1、SOD 和過氧化氫酶（CAT）等的活性及MDA 的表達，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[15-16]，從而提高機體抗氧化應(yīng)激的能力。

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者體內(nèi)氧化失衡伴隨著Nrf2活性降低，推測Nrf2 介導(dǎo)氧化應(yīng)激水平的升高。有報道稱，Nrf2 敲除的糖尿病腎病小鼠中ROS 大量積聚，造成腎損害[17]。Chen F 等人也發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病大鼠中膠原形成和腎間質(zhì)纖維化可被柚皮苷所改善，其機制與激活Nrf2 有關(guān)。Nrf2 已被視為治療糖尿病腎病的潛在靶點[18]。抗氧化酶HO-1 是Nrf2 的下游蛋白，是血紅素降解中的關(guān)鍵酶，可催化血紅蛋白降解產(chǎn)生膽綠素和CO 等產(chǎn)物，該產(chǎn)物能有效降低炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，對細胞起保護作用[19-20]。這些研究表明，誘導(dǎo)激活Nrf2/HO-1 通路可減少氧化應(yīng)激對腎臟的損傷。

杜仲黃酮是杜仲科植物杜仲的干燥樹皮中提取的主要成分。隨著對杜仲有效成分的深入研究發(fā)現(xiàn)，杜仲有較強的抗氧化活性和降血糖等作用，而杜仲提取物中含有大量黃酮類物質(zhì)。故本研究探討杜仲黃酮對糖尿病腎病小鼠氧化應(yīng)激信號通路的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病小鼠經(jīng)杜仲黃酮干預(yù)后，血糖明顯下降，血清腎功能指標(biāo)有所改善，還伴隨有腎臟組織SOD 活性升高，MDA 摩爾濃度降低。這提示我們，杜仲黃酮可改善糖尿病腎病小鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。隨著深入研究發(fā)現(xiàn)，杜仲黃酮可激活氧化應(yīng)激相關(guān)通路Nrf2 和HO-1 蛋白表達。

綜上所述，杜仲黃酮對糖尿病腎病小鼠腎臟的保護作用可能與其激活Nrf2 通路，上調(diào)下游因子HO-1表達，提高機體抗氧化的能力，進而降低腎臟組織中氧化應(yīng)激損傷，而起到腎臟保護作用。