耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌耐藥基因檢測及同源性

周鵬鵬，陳 娜，朱柯蕙，賈晨冉，張峰波，季 萍

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心,新疆 烏魯木齊 830054; 2. 新疆軍區(qū)保障部疾病預(yù)防控制中心，新疆 烏魯木齊 830054)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii，AB)是一種非發(fā)酵的革蘭陰性桿菌，是醫(yī)院感染重要致病菌之一[1]。AB可存在于正常人體皮膚、呼吸道、泌尿道以及自然環(huán)境中，常導(dǎo)致菌血癥、肺炎、腦膜炎、腹膜炎、心內(nèi)膜炎，以及泌尿道和皮膚軟組織感染。近年來抗菌藥物的濫用，侵襲性操作不規(guī)范等因素導(dǎo)致AB檢出率及耐藥率逐年增加，甚至造成AB醫(yī)院感染流行[2]。耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumanniiCRAB)是指對亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗生素耐藥的AB[3]，目前認(rèn)為產(chǎn)碳青霉烯酶是AB對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因[4]。為了解該院CRAB耐藥基因攜帶情況及其醫(yī)院感染的可能途徑，收集該院CRAB，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行耐藥基因檢測，脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)進(jìn)行同源性分析，以期為臨床合理應(yīng)用抗菌藥物，制定AB醫(yī)院感染防控措施提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集該院2017年10月—2018年10月分離的CRAB，剔除同一患者分離的重復(fù)菌株。分離菌株經(jīng)全自動微生物鑒定及藥敏儀進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn)，部分藥敏試驗(yàn)及復(fù)核采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)，藥敏結(jié)果依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2018版判斷。以大腸埃希菌ATCC 25922,銅綠假單胞菌ATCC 27853，產(chǎn)酶大腸埃希菌ATCC 35218,肺炎克雷伯菌ATCC 700603為質(zhì)控菌株。

1.2 主要試劑及儀器 PCR試劑盒，F(xiàn)TAfor Bacterial DNA(美國Whatman公司)。2×Taq PCR Green Mix、GenGreen 核酸染料、DL2000 DNA Marker、DNA快速純化/回收試劑盒均為北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。PCR反應(yīng)引物由上海生工生物工程有限公司合成。VITEK-MS、VITEK Compact均為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，藥敏紙片為英國Oxoid公司產(chǎn)品。還包括超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、游標(biāo)卡尺(上海精益儀器廠)、微量移液器(Eppendorf)、細(xì)菌比濁儀(法國生物梅里埃公司)、PCR儀(BIO-RAD)、電泳儀(北京六一儀器廠)、UV凝膠成像紫外分析儀(北京君益東方電泳設(shè)備有限公司)、紫外透照臺(上海山富科學(xué)儀器有限公司)、微波爐(美的集團(tuán)有限公司)、壓力蒸汽滅菌器(山東新華醫(yī)療器械有限公司)、脈沖場凝膠電泳儀(美國Bio—Rad公司)。

1.3 耐藥基因檢測 用FTA卡提取各株細(xì)菌的DNA，所用引物見表1，PCR擴(kuò)增體系為：2×Taq PCR Green Mix 12.5 μL，DNA模板2.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8 μL，共25 μL?；驍U(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性60 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，72℃終止延伸5 min，共30個循環(huán)。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物置于電泳儀中進(jìn)行電泳，條件為60 V，時間1 h，電泳后放入凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。

1.4 PFGE同源性檢測 將CRAB分離培養(yǎng)后，用比濁儀調(diào)成OD值為3.6～4.0的菌懸液，加入1% Seakem Gold SDS膠制備膠塊，再用蛋白酶K進(jìn)行裂解消化，純水洗滌2次，再用TE洗滌4次，每次15 min左右。使用ApaI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，37℃水浴中孵育4 h。在脈沖場凝膠電泳儀中進(jìn)行PFGE，電泳參數(shù)為5～20 s，14℃，120°脈沖角度電泳19 h，電泳結(jié)束后進(jìn)行核酸染色，放入凝膠儀中進(jìn)行觀察并拍照保存。

表1 耐藥基因PCR引物序列及產(chǎn)物長度

Table 1 PCR primer sequence and product length of drug resistance genes

基因名稱序列(5'-3')長度 (bp)ADCP1 GGTATGGC(T/C)GTGGG(T/C/G)GT(T/C)ATTC445P2 CTAAGA(C/G)TTGGTC(G/A)AA(A/G)GGTOXA-23P1 GATGTGTCATAGTATTCGTCG1 067P2 TCACAACAACTAAAAGCACTGOXA-51P1 ATGAACATTAAAGCACTCTTACTT825P2 CTATAAAATACCTAATTGTTCTAAKPCP1 ATGTCACTGTATCGCCGTCTA822P2 TTACTGCCCGTTGACGCCCAACTX-M-9P1 GCGCATGGTGACAAAGAGAGTGCAA877P2 GTTACAGCCCTTCGGCGATGATTCintl1P1 CCGAGGATGCGAACCACTTC373P2 CCGCCACTGCGCCGTTACCAqacE△l-sullP1 TAGCGAGGGCTTTACTAAGC300P2 ATTCAGAATGCCGAACACCGtnpuP1 CCAACTGATGGCGGTGCCTT403 P2 CGGTATGGTGGCTTTCGCant(3″)-IP1 TGATTTGCTGGTTACGGTGAC284P2 CGCTATGTTCTCTTGCTTTTGaac(3)-IP1 AACTACTCCCAACATCAGCC303P2 GTTGAACGCTCGCTAGGCTTEMP1 TGCTTAATCAGTGAGGCACC972 P2 TCGGGGAATGTGGGtraAP1 AAGTGTTCAGGGTGCTTCTGCGC272P2 AAATGGTCATCATGTACATGAC

1.5 數(shù)據(jù)分析 將凝膠成像儀保存的圖像導(dǎo)入BioNumerily軟件進(jìn)行處理分析，以Dice系數(shù)計算出各菌株之間的相似性系數(shù)[5]。SD=2nxy/(nx+ny)，其中nx代表菌株X的總條帶數(shù)，ny代表菌株y的總條帶數(shù)，nxy為菌株xy共有的條帶數(shù)，SD反映的是菌株相似度，范圍在0～1之間，0代表完全不一樣，1代表完全相同，相似性系數(shù)80%為分型界值，相似度≥80%為同一亞型，相似度<80%為不同基因型。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共收集40株CRAB，分離自40例患者的標(biāo)本。標(biāo)本來源分別為血管導(dǎo)管尖端(9株)、引流液(5株)、血(5株)、支氣管灌洗液(5株)、尿(4株)、分泌物(4株)、痰(4株)、腦脊液(2株)、腹腔積液(1株)、膽汁(1株)，28株CRAB來自于重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)。40例患者中男性29例(72.5%)，女性11例(27.5%)；年齡12 d～76歲，>50歲者21例(52.5%)。

2.2 抗菌藥物敏感情況 CRAB對替加環(huán)素耐藥率最低(為2.9%)，對阿米卡星、哌拉西林耐藥率分別為37.0%、42.9%。對其他大多數(shù)抗菌藥物的耐藥率均>70%。該院同期AB對替加環(huán)素、阿米卡星、妥布霉素、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率分別為1.9%、23.3%、37.3%、23.0%,對其他抗菌藥物的耐藥率均>50%。見表2。

表2 CRAB及AB對常用抗菌藥物的耐藥情況

Table 2 Resistance of CRAB and AB to commonly used antimicrobial agents

抗菌藥物CRAB檢測株數(shù)R(%)S(%)AB檢測株數(shù)R(%)S(%)哌拉西林7 42.957.1 9174.725.3氨芐西林/舒巴坦31 71.012.959357.533.9哌拉西林/他唑巴坦32 81.3 3.155462.132.7頭孢曲松40 80.0 0.096966.410.3頭孢吡肟40 87.510.098067.931.0頭孢哌酮/舒巴坦12 75.0 8.358223.043.3亞胺培南36100.0 0.097963.835.5美羅培南36100.0 0.081967.032.6阿米卡星27 37.063.055023.374.7慶大霉素40 95.0 5.097162.736.0妥布霉素36 55.641.797737.359.8替加環(huán)素352.925.7793 1.962.0左氧氟沙星36 91.7 5.697953.835.6環(huán)丙沙星36 97.2 0.098067.032.1

注：R表示耐藥；S表示敏感；表中未列出中介結(jié)果。

2.3 主要耐藥基因檢測結(jié)果 40株CRAB均檢出ADC基因，其他耐藥基因檢出率較高的依次為OXA-51(90.0%)、qacE△1-sull(80.0%)、OXA-23(77.5%)、intl1(72.5%)，未檢測出KPC基因。每株CRAB菌株檢出2～8種耐藥基因，以檢出6種耐藥基因的菌株最多(37.5%)；檢出的耐藥基因組合中，以同時檢出ADC+OXA-23+OXA-51基因最多(29株，72.5%)，其次為ADC+intl1+qacE△1-sull基因(26株，65.0%)、ADC+qacE△1-sull+ant(3″)-Ⅰ基因(19株，47.5%)、ADC+OXA-23+OXA-51+intl1+qacE△1-sull基因(18株，45.0%)，11株(27.5%)同時檢出ADC+ant(3″)-Ⅰ+aac(3)-Ⅰ基因。見表3、圖1。

表3 40株CRAB 主要耐藥基因檢出情況

Table 3 Resistance of 40 strains of CRAB to commonly used antimicrobial agents

項(xiàng)目株數(shù)比率(%)耐藥基因 ADC40100.0 OXA-5136 90.0 qacE△1-sull32 80.0 OXA-2331 77.5 intl129 72.5 ant(3″)-I23 57.5 TEM23 57.5 aac(3)-I14 35.0 tnpu 6 15.0 traA 37.5 CTX-M-9 12.5耐藥基因種類(種) 212.5 4615.0 5512.5 61537.5 7717.5 8615.0

M:Marker；1、2、3、7、11分別為ADC、OXA-23、OXA-51、qacE△1-sull、TEM基因擴(kuò)增結(jié)果

圖1 部分耐藥基因PCR擴(kuò)增圖

Figure 1 PCR amplification map of partial resistance genes

2.4 PFGE分型結(jié)果 40株CRAB PFGE圖譜可見電泳條帶數(shù)在22～29條不等，見圖2。分為A1～A19 19種不同型帶，每種帶型包含菌株數(shù)為1～9株不等，其中菌株4、10、12、13、16、28、32、33、34為A5型，菌株1、8、17、20、29、35、37、38為A18型，菌株2、7、25、39、40為A9型，菌株15、23為A13型，菌株6、14為A17型，其余14種帶型分別只包含1株菌。多株為同一型者，主要來源于ICU、呼吸ICU、兒科ICU。見圖3。

M：DNA Marker；1～10：CRAB菌株

Figure 2 Electrophoresis map of PFGE of partial CRAB strains

圖3 40株CRAB的PFGE聚類樹圖

3 討論

CRAB是我國醫(yī)院感染重要的病原菌之一，隨著抗菌藥物和免疫抑制劑的廣泛使用，AB耐藥率逐年上升，嚴(yán)重威脅人類健康并成為日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[6]，尤其是ICU AB感染率及病死率均相對較高，已成為臨床治療的棘手問題。

CRAB對抗菌藥物耐藥機(jī)制具有多樣性和復(fù)雜性，耐藥機(jī)制主要包括;(1)產(chǎn)生碳青霉烯酶;(2)主動外排系統(tǒng)過度表達(dá);(3)外膜孔蛋白下調(diào)或缺失;(4)抗菌藥物作用靶點(diǎn)發(fā)生改變;(5)形成生物膜;(6)多種可移動遺傳元件(整合子、插入序列、轉(zhuǎn)座子)傳播細(xì)菌的耐藥性等耐藥機(jī)制。碳青霉烯酶的產(chǎn)生是最常見也是最主要的耐藥機(jī)制。碳青霉烯酶按照Ambler分子分類法可分為4類，包括A(絲氨酸蛋白酶)、B(金屬β-內(nèi)酰胺酶)、C(頭孢菌素酶)、D(苯唑西林酶)類。D類酶即OXA類酶,具有遺傳多樣性,主要包括OXA-23、OXA-58、OXA-24及OXA-51。研究[7]顯示，AB對碳青霉烯類耐藥與OXA-23家族的關(guān)系越來越密切。

OXA-51 和OXA-23檢出率分別為90.0%、77.5%，OXA-23基因檢出率與國內(nèi)文獻(xiàn)[8]報道基本相近，未檢出新的亞型。CRAB出現(xiàn)與整合子對耐藥基因的積累有很大相關(guān)性,整合子是一種捕獲耐藥基因并可進(jìn)行傳播的原件，存在于染色體，質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子上。與AB耐藥有關(guān)的主要是Ⅰ～Ⅲ類整合子, 其中Ⅰ類整合子最多見.該院Ⅰ類整合子(intl1基因)檢出率為72.5%，與國內(nèi)文獻(xiàn)[9]報道基本相似。

氨基糖苷類耐藥基因ant(3″)-Ⅰ和aac(3)-Ⅰ檢出率分別為57.5%、35.0%，文獻(xiàn)報道16S rRNA甲基化酶可引起細(xì)菌對氨基糖苷類抗生素耐藥[10],這類基因可通過多種途徑在菌株之間傳播，如轉(zhuǎn)座子、整合子及質(zhì)粒等，有導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)流行的可能[11]，且不同醫(yī)院或同一醫(yī)院的不同時間段氨基糖苷類耐藥基因流行情況是不完全相同的[12]。本研究結(jié)果顯示，同時含有氨基糖苷類耐藥基因ant(3″)-Ⅰ+aac(3)-Ⅰ CRAB菌株僅有11株，此類基因不是該院流行的主要耐藥基因。

消毒劑耐藥基因qacE△1-sull檢出率為80.0%，對于消毒劑耐藥基因目前研究最多的是季銨鹽類消毒劑耐藥基因， 即qac基因。qac基因家族包括qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacF 等[13]，臨床AB菌株攜帶qacE△1基因是普遍現(xiàn)象[14]，通過病原菌多種化合物外排泵基因表達(dá)而呈現(xiàn)耐藥。文獻(xiàn)[15]報道qacE△1-sull檢出率在90%以上，該院qacE△1-sull檢出率為80%,略低于文獻(xiàn)報道，但也應(yīng)重視。本研究中整合子耐藥基因intl1檢出率為72.5%，整合子可使qacE△1-sull基因在AB之間進(jìn)行基因傳播，推測該院qacE△1-sull基因檢出率高可能與整合子耐藥基因檢出率高有關(guān)。該院轉(zhuǎn)座子耐藥基因檢出率為15.0%，相對較低。TEM型β-內(nèi)酰胺酶屬于廣譜β-內(nèi)酰胺酶，其編碼基因位于耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子Tnl序列上，可以通過編碼質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌中，可水解第三代頭孢菌素，此也是近年來AB臨床分離株對頭孢類抗生素耐藥程度不斷增加的主要原因。ADC檢出率高達(dá)100%，說明ADC為AB的固有耐藥基因。研究[16]顯示，ADC當(dāng)其編碼基因突變時將改變對藥物的水解能力。接合型質(zhì)粒耐藥基因traA檢出率為7.5%。此次檢測并未發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因型。

該院使用的氨基糖苷類抗生素是慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星。本研究中40株CRAB對慶大霉素耐藥率高達(dá)95.0%，氨基糖苷類耐藥基因ant(3″)-I和aac(3)-Ⅰ檢出率分別為57.5%、35.0%，氨基糖苷類耐藥基因檢出率與對慶大霉素的耐藥率不完全一致，但與對阿米卡星、妥布霉素的耐藥率(分別為37%、55.6%)基本相符；對亞胺培南、美羅培南耐藥率均為100.0%，而碳青霉烯酶耐藥基因總檢出率小于90%，提示耐藥表型與耐藥基因存在差異[17]，AB耐藥機(jī)制復(fù)雜、多樣，差異的具體原因有待進(jìn)一步研究。

PFGE被譽(yù)為分子分型的金標(biāo)準(zhǔn)，在同源性分析中被廣泛應(yīng)用[18]。對該院收集的40株CRAB進(jìn)行同源性分析，分為19種不同帶型,每種帶型菌株數(shù)1～9株不等，其中14種帶型(73.68%)分別只包含1株菌，其他5種(26.32%)帶型菌株數(shù)2～9株不等。39株菌相似性較高，相似度大于80%。對于相似度為100%的菌株可考慮為同一克隆株，通過聚類分析得出該院主要流行菌株以A5(9株)、A18(8株)型為主，這些菌株多數(shù)來自于ICU，說明該院有克隆株傳播。

本研究CRAB菌株量偏少，未對亞胺培南和美羅培南單藥耐藥的CRAB進(jìn)行研究，可能會遺漏一部分因OXA-23基因缺失，導(dǎo)致AB對亞胺培南敏感性增加[19]的情況，后續(xù)將收集更多不同類型標(biāo)本，進(jìn)行耐藥性與耐藥基因關(guān)系以及同源性的分析。本研究未檢測出KPC基因，可考慮用KPC顯色平板法進(jìn)行復(fù)核驗(yàn)證。

綜上所述，該院CRAB耐藥形勢嚴(yán)峻，應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)院感染控制的主動監(jiān)測，從而預(yù)防CRAB克隆株的播散。