基于Wnt／β-catenin信號(hào)通路探討陽(yáng)和湯對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎的影響

黃澤靈 ，何俊君 ，施珊妮 ，洪振強(qiáng) ，2*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；2.中醫(yī)骨傷及運(yùn)動(dòng)康復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病，臨床表現(xiàn)以緩慢性關(guān)節(jié)疼痛、腫大、僵硬伴關(guān)節(jié)功能障礙為主。OA除了軟骨的損傷和退變外，還與滑膜炎癥、關(guān)節(jié)骨重塑、骨贅形成以及關(guān)節(jié)周圍肌力減弱等有關(guān)［1］。上述病變由不同分子組成的復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)來(lái)調(diào)節(jié)，其中包括Wnt／β-catenin信號(hào)通路，該通路在OA中被激活，可以調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的成熟、軟骨外基質(zhì)分解代謝等，對(duì)Wnt／βcatenin通路的調(diào)控成為OA的治療靶標(biāo)［2］。近年來(lái)，陽(yáng)和湯在治療膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）的臨床運(yùn)用中取得了良好療效［3-5］，研究表明陽(yáng)和湯能抑制軟骨細(xì)胞凋亡，減少軟骨外基質(zhì)破壞，減少炎癥因子表達(dá)，從而延緩OA進(jìn)展［6-8］，但具體機(jī)制仍未明確。本研究通過(guò)關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶建立兔KOA模型，并予陽(yáng)和湯干預(yù)，觀察其對(duì)炎癥反應(yīng)、Wnt／β-catenin信號(hào)通路及軟骨組織的影響，探討陽(yáng)和湯防治OA的作用機(jī)制，為臨床使用陽(yáng)和湯治療KOA提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4～6月齡健康新西蘭大白兔24只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄各半，購(gòu)于上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017-0008。委托福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK（閩）2014-0006］代購(gòu)并飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 陽(yáng)和湯藥物組成：熟地黃30 g，肉桂 3 g，麻黃 2 g，鹿角膠 9 g，白芥子 6 g，姜炭 2 g，生甘草3 g，購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院；西樂(lè)葆（輝瑞制藥有限公司）。

1.3 主要試劑及儀器 木瓜蛋白酶（美國(guó)Sigma公司）；HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；即用型免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限 公 司 ）；Rabbit Anti-Wnt4 antibody、Rabbit Antiβ-catenin antibody（Proteintech Group）；DAB 顯色試劑盒（博士德生物工程有限公司）；ELISA檢測(cè)試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。自動(dòng)脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)（孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；石蠟切片機(jī)、光鏡（德國(guó)徠卡公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 將24只4～6月齡健康新西蘭兔隨機(jī)分為空白組、模型組、西樂(lè)葆組和陽(yáng)和湯組，每組6只。

2.2 模型建立 空白組予常規(guī)飼養(yǎng)，不予造模；其余3組分別在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1、4、7天采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶進(jìn)行造模［9-11］，動(dòng)物麻醉后，膝關(guān)節(jié)周圍備皮消毒，注射0.1 mL木瓜蛋白酶溶液至關(guān)節(jié)腔，注射后用棉球壓住針眼并再次屈伸膝關(guān)節(jié)使木瓜蛋白酶溶液充分浸潤(rùn)至整個(gè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)。每日強(qiáng)迫動(dòng)物于空地上活動(dòng)30 min，分2次進(jìn)行，連續(xù)驅(qū)趕4周后可獲得OA模型。模型鑒定：進(jìn)行膝關(guān)節(jié)Lequesne MG評(píng)分［12］，總分≥4分表示造模成功，可納入進(jìn)行藥物干預(yù)。

2.3 藥物干預(yù) 按成人體表面積與家兔體表面積換算［13］，陽(yáng)和湯組按 6 g／（kg·d）予陽(yáng)和湯灌胃，西樂(lè)葆組按 24 mg／（kg·d）予西樂(lè)葆灌胃，空白組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)給藥2周。

2.4 標(biāo)本的采集與制備 停藥1周后采集標(biāo)本，標(biāo)本采集前各組動(dòng)物禁食不禁水。腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL／kg）麻醉動(dòng)物。行髕骨上緣橫向切口，逐層分離至關(guān)節(jié)囊，屈曲并輕輕擠壓膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)，用注射器抽取集中在脛骨平臺(tái)的關(guān)節(jié)液存入EP管中，迅速投入液氮中保存。取雙膝關(guān)節(jié)股骨髁，清除周邊結(jié)締組織，用4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫鈣、包埋和切片。

2.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法 測(cè)量4組干預(yù)前后膝關(guān)節(jié)局部皮溫、周徑；Lequesne MG評(píng)分評(píng)估藥物干預(yù)前后膝關(guān)節(jié)功能；ELISA法檢測(cè)關(guān)節(jié)液中 IL-1β、TNF-α、MMP-13含量；光鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨病理改變和進(jìn)行Mankin's評(píng)分［14］；免疫組化檢測(cè)軟骨組織Wnt4、β-catenin表達(dá)情況及陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域積分光密度（IOD）。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，若方差齊，采用LSD法進(jìn)行各組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Games-Howell法進(jìn)行兩兩比較。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間比較采用多樣本秩和檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

3 結(jié) 果

3.1 4組局部皮溫、膝關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG評(píng)分比較 見(jiàn)表1。

表1 4組局部皮溫、膝關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG評(píng)分比較

表1 4組局部皮溫、膝關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG評(píng)分比較

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別空白組模型組西樂(lè)葆組陽(yáng)和湯組n 6 6 6 6局部皮溫／℃36.017±0.172 38.003±0.7691）37.500±0.5021）37.317±0.8891）關(guān)節(jié)周徑／cm 9.917±0.842 12.500±0.5141）11.250±0.3992）11.400±0.3101）2）Lequense MG評(píng)分／分0.000±0.000 5.167±0.4081）2.500±1.5171）2）3.000±0.6321）2）

3.2 軟骨組織HE染色 空白組軟骨表層光滑、平整，軟骨細(xì)胞分布均勻，序列整齊，層次清晰，軟骨細(xì)胞無(wú)簇集，潮線完整；模型組軟骨表面破損嚴(yán)重，基質(zhì)染色不均，表層軟骨細(xì)胞丟失，移形層軟骨細(xì)胞簇集，輻射層、鈣化層軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少、排列紊亂；陽(yáng)和湯組軟骨表層較光滑，軟骨細(xì)胞增多，排列較規(guī)則，局部細(xì)胞集簇，基質(zhì)染色尚均勻，潮線完整；西樂(lè)葆組軟骨表層不平整，可見(jiàn)小缺損，軟骨細(xì)胞增多，排列尚規(guī)則，少量細(xì)胞集簇，染色尚均勻，潮線完整，見(jiàn)圖1。

3.3 4組關(guān)節(jié)軟骨病理切片Mankin's評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 4組關(guān)節(jié)軟骨病理切片Mankin's評(píng)分比較

表2 4組關(guān)節(jié)軟骨病理切片Mankin's評(píng)分比較

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別空白組模型組西樂(lè)葆組陽(yáng)和湯組n 6 6 6 6 Mankin's評(píng)分0.3±0.51 5.3±1.211）3.0±0.891）2）3.1±1.161）2）

3.4 4組關(guān)節(jié)軟骨中Wnt4、β-catenin的含量比較見(jiàn)表3。

表3 4組軟骨組織Wnt4、β-catenin免疫組化 IOD 比較

表3 4組軟骨組織Wnt4、β-catenin免疫組化 IOD 比較

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別空白組模型組西樂(lè)葆組陽(yáng)和湯組n 6 6 6 6 Wnt4 622.939±162.435 26079.237±2818.9881）3188.485±530.8651）2）3270.973±866.6761）2）β-catenin 1006.996±119.740 22149.471±4714.0921）3844.582±447.7331）2）3792.487±1213.2651）2）

3.5 4組關(guān)節(jié)液中 IL-1β、TNF-α、MMP-13 含量比較 見(jiàn)表4。

4 討 論

OA屬中醫(yī)“痹證”“骨痹”“膝痹”等范疇，陽(yáng)虛寒凝型是其常見(jiàn)類型［15-17］，其主要病機(jī)為稟賦不足或素體陽(yáng)虛，筋脈失于溫煦，寒從中生，或復(fù)感風(fēng)寒濕邪致四肢冷感，遇寒痛增。寒性收引，筋脈收縮攣急，故肢體屈伸不利，若寒邪夾濕，阻滯經(jīng)絡(luò)關(guān)節(jié)，陽(yáng)氣不得布達(dá)，則見(jiàn)關(guān)節(jié)酸痛重著［18］。陽(yáng)和湯源自清代王洪緒《外科證治全生集》，主治陽(yáng)虛寒凝證，若痹證日久，外邪蟄伏于筋骨之間，祛邪困難，此時(shí)單純以溫里散寒則邪無(wú)出路，單純以開(kāi)表宣痹則里寒不除，表里不通，經(jīng)絡(luò)阻隔，難以取效。陽(yáng)和湯既用肉桂、炮姜溫里散寒，破陰扶陽(yáng)以溫里；又用麻黃辛溫發(fā)散，開(kāi)達(dá)腠理，宣散寒邪以疏表；再用白芥子散寒祛濕，利氣通滯，以通達(dá)表里，是臨床上攻補(bǔ)兼?zhèn)?、剛?cè)嵯酀?jì)之治痹良方，臨床研究證明陽(yáng)和湯治療 KOA 療效良好［3-5］。

表 4 4 組關(guān)節(jié)液中 IL-1β、TNF-α、MMP-13 含量比較

表 4 4 組關(guān)節(jié)液中 IL-1β、TNF-α、MMP-13 含量比較

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

組別空白組模型組西樂(lè)葆組陽(yáng)和湯組n 6 6 6 6 IL-1β 11.614±7.004 45.523±31.4891）16.439±10.9371）2）12.932±3.0041）2）TNF-α 164.865±66.339 300.382±27.9931）171.315±39.6661）2）176.641±7.7691）2）MMP-13 125.867±28.266 393.252±110.9891）206.359±65.7881）2）198.437±37.6881）2）

關(guān)節(jié)軟骨的損傷退變及炎癥反應(yīng)是骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的重要因素，許多研究表明Wnt信號(hào)通路可能與OA進(jìn)展和嚴(yán)重程度相關(guān)。Wnt是脊椎動(dòng)物中的分泌型糖蛋白［19］，可以激活不同的級(jí)聯(lián)信號(hào)，其中β-catenin是Wnt信號(hào)通路的經(jīng)典途徑，該途徑的失調(diào)被認(rèn)為是癌癥、慢性炎癥和退行性疾病發(fā)病機(jī)理的核心［2］。Wnt蛋白可以與Wnt受體復(fù)合物結(jié)合，該受體復(fù)合物由卷曲受體（FZD）和共激活因子脂蛋白相關(guān)蛋白受體5或6（LRP5／6）組成。在Wnt與其受體相互作用后，將帶有β-catenin的多蛋白復(fù)合物束縛向細(xì)胞膜，從而保護(hù)β-catenin免于降解，隨后β-catenin在細(xì)胞中積累并易位至細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子 ／淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子（TCF／Lef）結(jié)合，激活 βcatenin 的轉(zhuǎn)錄活性［20］。 過(guò)表達(dá)的 Wnt／β-catenin 一方面通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞的增殖及Ⅱ型膠原蛋白的分泌導(dǎo)致軟骨退化，一方面導(dǎo)致滑膜成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖和Ⅰ型膠原沉積引起滑膜炎癥的發(fā)生發(fā)展［21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組軟骨組織中Wnt4和β-catenin高表達(dá)，經(jīng)過(guò)治療后二者表達(dá)量明顯下降、炎癥反應(yīng)及軟骨退變程度明顯改善，提示陽(yáng)和湯對(duì)兔KOA的防治作用可能與Wnt／β-catenin通路被抑制有關(guān)。

研究表明，OA關(guān)節(jié)組織和滑液中均存在促炎細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等［22］。 IL-1β 是參與軟骨破壞的主要促炎細(xì)胞因子，在原代培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中誘導(dǎo)Wnt-5a和Wnt-7a的表達(dá)，Wnt表達(dá)也刺激了軟骨細(xì)胞中 β-catenin 的水平升高［23］；而 TNF-α 能誘導(dǎo)滑膜組織中β-catenin、MMP-7等因子的分泌，從而促進(jìn)滑膜炎癥的進(jìn)一步發(fā)展［24］。由此說(shuō)明IL-1β和TNF-α可能通過(guò)Wnt／β-catenin通路驅(qū)動(dòng)OA炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)軟骨退變?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在軟骨退化中起著重要的作用，在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MMP-1、MMP-9和MMP-13的mRNA高表達(dá)，其中MMP-13與OA密切相關(guān)，其表達(dá)量隨著骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展而逐漸增加，且MMP-13是 Wnt／β-catenin 信號(hào)通路的下游因子［25］，受該通路的調(diào)控。IL-1β和TNF-α對(duì)軟骨中MMPs的表達(dá)還有直接的誘導(dǎo)作用，既能刺激MMPs在軟骨降解中發(fā)揮作用，還能阻斷新細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成［26］。

本實(shí)驗(yàn)中各組皮溫、膝關(guān)節(jié)周徑、Lequesne MG評(píng)分結(jié)果顯示，陽(yáng)和湯組兔子膝關(guān)節(jié)顯示出較輕的炎癥表現(xiàn)；軟骨組織光鏡觀察及Mankin's評(píng)分顯示陽(yáng)和湯對(duì)OA軟骨組織具有保護(hù)作用。課題組前期研究和本次實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明陽(yáng)和湯防治OA的作用部分可能是通過(guò)降低炎癥因子TNF-α和 IL-1β 的表達(dá)，抑制 Wnt／β-catenin信號(hào)通路，改善MMP-13對(duì)軟骨退變的影響來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但其具體機(jī)制有待于更深入的實(shí)驗(yàn)研究。