優(yōu)化HPLC進行甘地膠囊中黃芩苷的含量測定

徐人杰 ，黃 潔 ，徐阿晶

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院，上海 200092；2.紹興市婦幼保健院，浙江 紹興 312000）

甘地膠囊（gandicapsule，GDC）為上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院自制制劑（批準文號：滬藥制字Z04180947；委托上海方心制藥科技有限公司生產(chǎn)）。甘地膠囊具有益氣養(yǎng)陰、活血祛瘀的功效，目前臨床常用于治療糖尿病及糖尿病引起的微血管病變，療效確切［1-3］。魏昕等［4］發(fā)現(xiàn)甘地膠囊可聯(lián)合常規(guī)治療用于糖尿病腎病，療效及安全性均較好。甘地膠囊由八味中藥構(gòu)成，其中黃芪、黃芩和山茱萸為君藥。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷為甘地膠囊主要成分［5-7］，同時大鼠藥動學(xué)實驗也證實，黃芩苷為甘地膠囊口服后主要入血成分［8］?，F(xiàn)有文獻顯示黃芩苷及其苷元具有一系列藥理活性［9-10］。因此，針對甘地膠囊中黃芩苷的質(zhì)量控制便尤為重要。應(yīng)用HPLC測定黃芩藥材或其他制劑中黃芩苷的研究已有報道［11-14］，但前期研究中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用現(xiàn)有HPLC法測定甘地膠囊中的黃芩苷結(jié)果不穩(wěn)定，測定的結(jié)果也容易產(chǎn)生較大誤差，所以有必要優(yōu)化測定方法，提高實驗方法的靈敏度。本文通過優(yōu)化的HPLC法測定黃芩苷的含量，建立甘地膠囊的質(zhì)量標準，以確保制劑安全有效。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Waters Symmtry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；G131513 二極管陣列檢測器。

1.2 試藥 黃芩苷（批號110715-200514，中國藥品生物制品檢定所）；樣品（批號20161202、20161203、20161204，上海方心制藥科技有限公司）；流動相用甲醇（色譜純，美國Merck公司）；其余試劑均為分析純，購自中國醫(yī)藥（集團）上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 選用Waters Symmtry C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱；參照《中國藥典》2015版［15］黃芩含量測定項下黃芩苷的含量測定方法，流動相為甲醇：0.4%磷酸（43∶57）；流速 1.0 mL／min；柱溫25℃；檢測波長為280 nm。黃芩苷峰分離的理論塔板數(shù)不應(yīng)低于2 500。

2.2 對照品溶液的配制 取黃芩苷對照品，精密稱定，加適量甲醇，溶解成儲備液，其濃度為0.319 mg／mL。隨后精密吸取貯備液適量，繼續(xù)加入甲醇稀釋，搖勻，得黃芩苷對照品溶液，其質(zhì)量濃度為31.9 μg／mL。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

2.3.1 波長的選擇 經(jīng)液相紫外光譜全波長掃描比較后發(fā)現(xiàn)，黃芩苷在280 nm處具有最大吸收波長。同時掃描供試品及對照品溶液后發(fā)現(xiàn)，兩者的黃芩苷紫外光圖譜一致。

2.3.2 流動相選擇 根據(jù)既往文獻，本試驗設(shè)置了3種比例的流動相配比，其中當采用甲醇：0.4%磷酸（47∶53）時，供試品溶液出峰時間 8 min，但有雜峰混入，黃芩苷峰受到干擾不純；當采用甲醇：0.4%磷酸（45∶55）時，供試品溶液出峰時間 10 min，分離度 1.46，未達到分離要求；甲醇：0.4%磷酸（43∶57），供試品溶液出峰時間13 min，分離度達到要求，出峰時間前后也未發(fā)現(xiàn)雜峰。同時在上述流動相比例下供試品溶液中的黃芩苷與基質(zhì)雜峰實現(xiàn)了良好的基線分離，見圖 1。

2.4 提取條件的選擇 考察不同提取溶劑、提取方法、提取時間下甘地膠囊中黃芩苷的提取，明確黃芩苷供試品溶液的制備方法。取裝量差異下的甘地膠囊內(nèi)容物約0.1 g，精密稱定后置量瓶中，加70%乙醇直至刻度線，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再次加70%乙醇至刻度，收集其過濾后的續(xù)濾液即得供試品溶液。陰性對照無干擾，見表1。

表1 提取條件選擇結(jié)果比較（批號20161202，μg／kg）

2.5 黃芩苷標準曲線及定量限確定 精密吸取對照品溶液各 1 μL，2 μL，5 μL，10 μL，貯備液 2 μL，5 μL，10 μL，液相色譜法分別測定峰面積計算。 標準曲線回歸方程為：y＝5.683 8＋3150.272 3x，r＝1。其中x為進樣量（μg），y為黃芩苷的峰面積。本方法下黃芩苷定量限為0.031 9 μg／mL。黃芩苷對照品在0.0319～3.19 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗 精密吸取10 μL對照品溶液（31.9 μg／mL）進樣，分別按上述處理條件連續(xù)重復(fù)進樣6次，測定液相色譜的峰面積，由上述標準曲線經(jīng)過計算得出黃芩苷含量進行精密度考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6組平行試驗所得黃芩苷的RSD為0.14%，表明本次實驗所建立方法的精密度良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性 取甘地膠囊（批號20161202），按黃芩苷供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，并于 0、2、4、6、8、24 h 測定峰面積（批號 20161202），結(jié)果發(fā)現(xiàn)6組平行試驗所得黃芩苷的RSD為0.49%，說明制備方法的穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗 取甘地膠囊（批號20161202），按黃芩苷供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，平行進行6次，記錄峰面積，結(jié)果平行試驗所得黃芩苷的RSD為0.43%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗 采用加樣回收法進行回收率考察試驗。精密稱取已知黃芩苷含量的甘地膠囊50 mg（批號20161202，含量為1.75%），置50 mL量瓶中，精密吸取3.0 mL黃芩苷對照品溶液（0.319 mg／mL）加入量瓶，隨后加70%乙醇適量溶解，按照供試品制備方法制備，該操作平行6份。取續(xù)濾液，根據(jù)建立的黃芩苷含量測定方法進行測定，結(jié)果如表2所示，6組供試品溶液的黃芩苷的平均加樣回收率為99.62%，RSD為0.86%。

表2 回收率試驗結(jié)果（n＝6）

2.10 樣品測定 取3批次甘地膠囊（規(guī)格：0.3 g／粒），根據(jù)建立的黃芩苷含量測定方法，進行制備進樣和含量測定，結(jié)果黃芩苷含量分別為1.75%，1.65%，1.52%，如表3所示。

表3 樣品測定結(jié)果

3 討 論

為了使黃芩苷的提取過程較完全徹底，且參考既往文獻黃芩藥材中通常選用70%乙醇為提取溶劑，因此本研究重點考察流動相、70%乙醇及乙醇。根據(jù)幾種方法下黃芩苷供試品溶液制備方法及最終得率綜合考察，選擇取樣量為0.1 g，50 mL容量瓶溶解，超聲30 min進行研究。經(jīng)過對提取溶劑的考察和比較，最終選擇70%乙醇作為本次試驗所采用的提取溶劑。

由于甘地膠囊在制備過程中已經(jīng)歷回流提取工藝過程，故本次實驗主要考察回流及超聲提取條件下黃芩苷含量的比較。通過比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)超聲及回流提取后的黃芩苷含量相近，考慮到操作過程的效率及便捷性，最終選擇超聲提取作為本次實驗的提取方法。同時通過幾組超聲時間的比較發(fā)現(xiàn)，超聲提取30 min下黃芩苷含量較高，為最佳的提取時間。

根據(jù)3批甘地膠囊中黃芩苷的含量測定結(jié)果進行分析，按照其平均含量的80%作為標準，以黃芩苷（C21H18O11）含量作為甘地膠囊中黃芩的質(zhì)量控制指標，不得少于3.9 mg。今后將通過數(shù)據(jù)的積累完善繼續(xù)精確甘地膠囊中的黃芩苷含量限度。

本研究建立的高效液相法可快速靈敏的測定甘地膠囊中黃芩苷的含量，經(jīng)方法學(xué)考察，測定結(jié)果準確可信，可作甘地膠囊質(zhì)量控制的指標之一。