文心蘭NPRl基因的克隆與誘導(dǎo)抗性過(guò)程中的表達(dá)分析

鄭世仲 王培育 張春柳 江勝滔 江金蘭 顏沛沛 葉煒 賴鐘雄

摘要：[目的]探明文心蘭NPRl基因在誘導(dǎo)抗性過(guò)程中的生理作用。[方法]利用RACE技術(shù)克隆文心蘭NPRl基因全長(zhǎng)，并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析和遺傳進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建;以印度梨形孢共培養(yǎng)、水楊酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）處理文心蘭，分析菊歐文氏桿菌導(dǎo)致的軟腐病抗性影響及NPRl基因的表達(dá)特性變化。[結(jié)果]克隆得到的2條基因序列長(zhǎng)度分別為l 804bp和l 902bp，編碼555、556個(gè)氨基酸，均為NPRl類型，分別命名為OgNPRl-1和OgNPRl-2;文心蘭兩個(gè)NPRl基因在未接菌的情況下均呈現(xiàn)低表達(dá)量，在接種共生菌印度梨形孢后輕微上調(diào)表達(dá)，在接種菊歐文氏桿菌后顯著上調(diào)表達(dá)，而在印度梨形孢共生菌的存在下，接種菊歐文氏桿菌使兩個(gè)NPRl基因表達(dá)更為活躍;同時(shí)，相比印度梨形孢共生菌處理，兩個(gè)NPRl基因均在外源SA、MeJA處理下接種菊歐文氏桿菌表現(xiàn)為更顯著上調(diào)表達(dá);此外，共生印度梨形孢可顯著提高文心蘭對(duì)菊歐文氏桿菌導(dǎo)致軟腐病的抗性，限制軟腐病病癥在非接病葉片的擴(kuò)展。[結(jié)論]在共生印度梨形孢的文心蘭植株中，印度梨形孢顯著提高了文心蘭NPRl基因響應(yīng)菊歐文氏桿菌的表達(dá)水平，雖然上調(diào)水平不及SA和MeJA激素處理的水平，卻使文心蘭植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的對(duì)抗軟腐病的能力。

關(guān)鍵詞：文心蘭;NPRl;誘導(dǎo)性抗性;印度梨形孢;菊歐文氏桿菌

中圖分類號(hào)：S 682.31文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2020）02-0140-10

0 引言

（研究意義）在植物中，系統(tǒng)性抗病機(jī)理存在兩種產(chǎn)生類型，一種是由致病菌及其特征物誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性（Systemic acquiredresistance，SAR），另一種為系統(tǒng)誘導(dǎo)性抗性（Induced systemic resistance，ISR），主要由非致病性根際微生物所誘導(dǎo)。早期認(rèn)為，ISR的產(chǎn)生可能依賴于谷胱甘肽一抗壞血酸循環(huán)的抗氧化能力的激活，茉莉酸（Jasmonic acid，JA）途徑相關(guān)基因的表達(dá)可能在ISR產(chǎn)生中起重要作用，并且在ISR形成過(guò)程中，防御基因（Defensegene）及水楊酸（Salicylic acid，SA）信號(hào)途徑相關(guān)基因被大量抑制。近年來(lái)，相關(guān)研究已經(jīng)表明ISR形成及作用過(guò)程可能存在更為復(fù)雜的機(jī)制，SA信號(hào)途徑相關(guān)基因在ISR病原菌入侵初期大量表達(dá)，并在其后的系統(tǒng)性抗性誘導(dǎo)中扮演重要角色。（前人研究進(jìn)展）非表達(dá)病程相關(guān)蛋白（Non-expresserofpathogenesis related genes l，NPRl）充當(dāng)植物防御信號(hào)的主要調(diào)節(jié)因子，廣泛參與植物的防御反應(yīng)。NPRl是一種SAR的正調(diào)控因子，植物傾向于連續(xù)地誘導(dǎo)NPRl及SA信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而啟動(dòng)防御基因表達(dá)，當(dāng)誘導(dǎo)SAR后，NPRl易位至細(xì)胞核，接著與基本結(jié)構(gòu)域/Leu拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子的TGA/OBF亞類成員相互作用，參與SA依賴性病程蛋白相關(guān)基因（Pathogenesis related genes，PR）的激活。NPRl同樣在ISR中起重要作用，與SAR相反，雖然ISR不依賴于SA的積累，但JA不能在擬南芥（Arabidosis thaliana）NPRl突變株中誘導(dǎo)ISR，表明JA誘導(dǎo)的ISR的啟動(dòng)同樣依賴于NPRl的作用。NPRl參與植株體內(nèi)SA與JA的平衡，在SA的存在下，NPRl參與抑制包括LOX2、VSP和PDFl.2mRNA水平的積累，是JA信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控因子;同時(shí)，NPRl又能抑制SA的從頭合成，提高JA信號(hào)途徑防御基因的表達(dá)。

文心蘭是我國(guó)特別是臺(tái)灣地區(qū)最主要的出口切花品種，極易受到軟腐病侵害，其病原物主要為歐文氏桿菌（Erwinia carotovora subsp.carotovora）與菊歐文氏桿菌（e.chrysanthemi，Pectobacteriumchrysanthemisyn，Dickya dadantii syn.nov.）。菊歐文氏桿菌寄主范圍廣泛，還未見(jiàn)具有其抗性的蘭花種質(zhì)被報(bào)道。印度梨形孢（Piriformospora indica）可為多種物種帶來(lái)系統(tǒng)性抗性，提高植株對(duì)抗病害的能力。在此前的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)印度梨形孢可以提高文心蘭系統(tǒng)性對(duì)抗軟腐病的能力，并且植株體內(nèi)SA、JA水平也在接種印度梨形孢后顯著提高，利用此前完成的轉(zhuǎn)錄組（PRJNA428913）分析發(fā)現(xiàn)文心蘭根部有兩個(gè)注釋為NPRl的基因片段。（本研究切人點(diǎn)）目前，蘭科植物中僅見(jiàn)關(guān)于蝴蝶蘭（Phalaenopsisaphrodite subsp.formosana）NPRl基因克隆分析的相關(guān)報(bào)道，而不同物種NPRl基因的功能存在差異。（擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題）為了解文心蘭NPRl基因在ISR過(guò)程中的生理作用，本試驗(yàn)通過(guò)克隆文心蘭NPRl基因全長(zhǎng)，分析其所屬類型及在印度梨形孢誘導(dǎo)的ISR過(guò)程中的表達(dá)情況，以期為揭示文心蘭抗軟腐病分子機(jī)理及抗性育種提供參考。

1材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

文心蘭南茜組培苗、菊歐文氏桿菌由三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院建立并保存，其培養(yǎng)及繼代參照江金蘭等的方法及楊學(xué)等的方法。印度梨形孢由臺(tái)北大學(xué)葉開(kāi)溫饋贈(zèng)并保存于三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，其培養(yǎng)及接種文心蘭植株參照葉煒等的方法。利用Trizol法（Invitrogen）抽提文心蘭RNA并于-80℃保存?zhèn)溆?，RLM-RACE試劑盒獲得cDNA全長(zhǎng)于-20℃保存?zhèn)溆?。PrimeScript RT reagent Kit withgDNA Eraser（Perfect Real Time）（Takara，RR047A）獲得cDNA用于實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time QuantitativePCR，qPCR）。

1.2NPRl基因全長(zhǎng)克隆及分析

利用pfam（pfam.xfam.org）下載NPRl/NIMl liksdefenceprotein C terminal種子文件（PFl2313），于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（PRJNA428913）進(jìn)行隱馬克夫模型（Hidden Markov models，HMMs）搜索，并利用所得到片段進(jìn)行RACE擴(kuò)增全長(zhǎng)，設(shè)計(jì)開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）的引物進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證，所用引物見(jiàn)表1.RACE及ORF擴(kuò)增使用2×TaqPCRMastermix（天根，KT201），參照說(shuō)明書(shū)及引物溫度進(jìn)行PCR反應(yīng)，陽(yáng)性條帶回收TA克隆后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，送博尚基因測(cè)序。利用DNAMAN 6.0進(jìn)行蛋白序列預(yù)測(cè)，NCBI BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行核酸及蛋白序列比對(duì)。利用NCBICD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。利用SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽分析。利用PSORT（https：//psort.hgc.jp/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.3NPRl進(jìn)化樹(shù)分析

所獲得OgNPRl-1、OgNPRl-2蛋白序列與擬南芥及其他物種NPRl及近似蛋白序列構(gòu)建Neghbo～Joining進(jìn)化樹(shù)，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)軟件為MEGA10.1，設(shè)置bootstrap=1000.擬南芥AtNPRl（A了1G64280）、AtNPR2（AT4G26120）AtNPR3（AT5G45110）AtNPR4（AT4G19660）、AtBOPl（AT3G57130）、AtBOP2（AT2G41370）下載自TAIR，其他物種NPRl及其近似序列包括葡萄（Vitis vinifera）VvNPRl.2（XP002274045入甜菜（Jetavulgaris）BvNIMl（AAT57640人大豆（Glycine max）GmNPRl-1（NP 001238658）、GmNPRl-2（NP 001238674）、煙草（Nicofianatabacum）NtNPRl（ABH04326）、可可（Rheobromacacao）TcNPRl（ADl24348）、白毛果楊（Populustrichocarpa）PtNPRl（XP 002308281）、PtNPR2（XP 002322351）、PtNPR4（XP 002307566）、PtBOPl（XP 002323261）、PtBOP2（XP 002308905）、秈稻（Oryzae sativa Indica Group）OsNPRl/NHl（AAXl8700）、粳稻（OryzasativaeJaponicaGroup）OsNPRl（AAP92751）、OsBOP2（ABEl 1621）、小果野蕉（Musa acuminata AAA Group）MaNPRl-B（ABl93182）、MaNPRl-A（ABL63913）、高粱（Sorghumbicolor）SbNPRl（XP 002455011）、SbNPR2（XP0024641lo）、SbNPR3（XP 002456404）、SbBOPl（XP002442682）、SbBOP2（XP 002450246）、湖北海棠（Malus hupehensis）MhNPRl（ADP95762）下載自NCBI GenBank.

1.4NPRl基因表達(dá)分析

利用與印度梨形孢共培養(yǎng)10d后的文心蘭組培苗（P），取每個(gè)植株第二片葉進(jìn)行菊歐文氏桿菌接種試驗(yàn)，以接種水的文心蘭為對(duì)照（CK），接菌24h后，收集接種部位葉片（PEL）和鄰近接種葉片（PED），對(duì)照文心蘭也收集相應(yīng)的部位葉片（EL）和鄰近接種葉片（ED）提取RNa.為了解NPRl在SA和JA信號(hào)下表達(dá)情況，利用1.0mmol·L^-1SA溶液，0.1mmol·L^-1茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）溶液噴灑文心蘭葉片，24h后收集提取RNa.利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（PerfectRealTime）試劑盒（Takara，RR047A）合成cDNa.以Act&為內(nèi)參進(jìn)行ABI QuantStudio 3熒光定量PCR儀進(jìn)行定量分析。利用Premix Ex Taq Ⅱ試劑（TAKARA，RR820A）參照說(shuō)明書(shū)及引物溫度進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。每個(gè)試驗(yàn)以5株為一個(gè)處理，試驗(yàn)3個(gè)獨(dú)立重復(fù)，利用DPS7.05進(jìn)行鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 文心蘭NPRl基因的克隆與生物信息學(xué)分析

利用HMMER從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得l條編號(hào)為Pl comig 4467序列，序列長(zhǎng)度為1238bp.NCBIBlast比對(duì)顯示該蛋白序列與蝴蝶蘭NPRl蛋白序列（AEP68016.1、XP 020587799.1）有83.53%、83.28%的一致性，具有NPRl likeC（pfaml2313）結(jié)構(gòu)域，表明該序列為NPRl基因。根據(jù)Pl contig 4467序列設(shè)計(jì)RACE引物（表1），經(jīng)序列拼接，分別獲得兩條長(zhǎng)度為1804、1902bp核酸序列，ORF分別為1668、1665bp，編碼556、555個(gè)氨基酸，與ORF引物擴(kuò)增驗(yàn)證一致。SignalP分析顯示，兩條序列均不含有信號(hào)肽。PSORT亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)為OgNPRl-1：質(zhì)膜60%，高爾基體40%，線粒體內(nèi)膜34.6%，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜30%;OgNPRl-2：質(zhì)膜65%，線粒體內(nèi)膜34.6%，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜20%，葉綠體片層膜17.3%。

通過(guò)NCBI保守結(jié)構(gòu)域分析兩條推斷蛋白序列表明，2條推斷蛋白序列均含有BTB POZ NPRplant（pfam00651）、DUF3420（pfaml 1900）、Ank 2（pfam12796）、NPRl like C結(jié)構(gòu)域。NBCIBlast結(jié)果顯示2條推斷蛋白序列與來(lái)自蝴蝶蘭的NPRl蛋白序列有較高一致性（表2）。利用DNAMAN 6.0將其與蝴蝶蘭、擬南芥的NPRl蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，呈現(xiàn)較高的保守性，并且與擬南芥NPRl蛋白序列Cvs⁸²和Cys²¹⁶位點(diǎn)一致（圖1）。2條序列分別命名為NPRl isoform Xl（OgNPRl-1）、NPRl isoform Xl（OgNPRl-2），序列登錄號(hào)分別為MN402677、MN402678.

2.2 文心蘭NPRl進(jìn)化樹(shù)分析

由于NPRl及近似基因具有不同的生理功能，利用其他物種已知的NPRl、近似蛋白序列與OgNPRl-l、OgNPRl-2構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明進(jìn)化樹(shù)分析與BLAST結(jié)果一致（圖2）。文心蘭2個(gè)NPRl蛋白與蝴蝶蘭、小果野蕉、水稻最為接近，與擬南芥NPRl、NPR2一起被聚類在NPRl類型。NPR3類群與BOP類群序列與預(yù)期一致，再次表明所分離的文心蘭OgNPRl基因?yàn)镹PRl類型。