羊口瘡病毒疫苗株和ORFV-PN株ORFV011基因的比較分析

林裕勝 江錦秀 張靖鵬 游偉 胡奇林

摘要：[目的]比較分析羊口瘡病毒疫苗株與ORFV-PN株ORFV011基因的分子特點(diǎn)、編碼蛋白的生物學(xué)功能差異，為福建省羊口瘡的科學(xué)防控提供理論指導(dǎo)。[方法]對(duì)羊口瘡疫苗株和ORFV-PN株ORFV011基因進(jìn)行克隆和測(cè)序，運(yùn)用生物信息學(xué)相關(guān)軟件比較分析兩者測(cè)序結(jié)果的差異。[結(jié)果]測(cè)序結(jié)果顯示，疫苗株和ORFV-PN株ORFV011基因均由1137個(gè)核苷酸組成，編碼378個(gè)氨基酸。核苷酸序列和氨基酸序列相似性比較顯示，ORFV-PN與疫苗株和弱毒株D1701株ORFV011基因核苷酸序列相似性分別為98.6%和98.4%，氨基酸序列相似性均為98.7%。與疫苗株相比，ORFV-PN株共有16處核苷酸變異和5處氨基酸變異。在蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)上，ORFV-PN株和疫苗株。α-螺旋占比分別為34.13%（129/378）和30.42%（115/378），β-轉(zhuǎn)角占比分別為6.08%（23/378）和6.88%（26/378），無(wú)規(guī)則卷曲占比分別為37.30%（141/378）和39.15%（148/378），β-折疊占比分別為22.49%（85/378）和23.54%（89/378）。蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)上，ORFV-PN株預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)與疫苗株的三維結(jié)構(gòu)在α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲上有一定的差異。[結(jié)論]福建省羊口瘡病毒ORFV011基因出現(xiàn)變異，應(yīng)當(dāng)引起廣大獸醫(yī)工作者的重視，有關(guān)部門(mén)應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)羊口瘡的監(jiān)測(cè)。

關(guān)鍵詞：羊口瘡病毒;疫苗株;ORFV-PN;ORFV011基因

中圖分類(lèi)號(hào)：S 852.659.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008-0384（2020）02-0124-06

0 引言

（研究意義）羊口瘡病毒（Orfvirus，ORFV）是一種變異性較強(qiáng)的病毒，病毒基因組長(zhǎng)度因毒株不同而有所區(qū)別。ORFVOll基因編碼的B2L蛋白是重要的免疫原性蛋白，是研究羊口瘡（Orf）新型疫苗的重要靶基因。通過(guò)比較分析羊口瘡病毒疫苗株和地方分離株ORFVOll基因的分子特點(diǎn)、編碼蛋白的生物學(xué)功能，可為福建省羊口瘡的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及疫苗選擇提供理論依據(jù)。（前人研究進(jìn)展）羊口瘡是羊口瘡病毒引起的一種接觸性人獸共患傳染病，該病的發(fā)病率在4%～100%，死亡率1%～59%不等。ORFV011基因全長(zhǎng)為1137bp，編碼42kDa左右蛋白，可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)。ORFVOll基因位于基因組中部高度保守區(qū)域，保守性較強(qiáng)，常利用該基因建立PCR診斷方法及分子流行病學(xué)調(diào)查。Wang等根據(jù)ORFVOll基因建立了SYBR GreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢查方法;Wang等根據(jù)ORFVOII基因?qū)Π不帐⊙蚩诏彶《痉蛛x株進(jìn)行鑒定及遺傳變異分析。從近年來(lái)ORFVOll基因分子遺傳特征的報(bào)道來(lái)看，該基因已經(jīng)出現(xiàn)一定程度的變異，如Nagaraian等研究發(fā)現(xiàn)印度分離株的ORFV011基因與羊口瘡病毒、偽牛痘病毒和牛丘疹性口炎病毒的同源性分別為98.14%、96.29%和83.59%。王秋霞等通過(guò)對(duì)江蘇省羊口瘡病毒的分離鑒定及ORFV011基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，4株分離株ORFVOll基因與疫苗株的同源性僅有96.8%～98.1%，暗示羊口瘡病毒已經(jīng)出現(xiàn)一定程度的變異。（本研究切入點(diǎn)）已有研究人員對(duì)羊口瘡病毒疫苗株和地方分離株FIL基因進(jìn)行了比較分析，然而對(duì)于疫苗株和地方分離株的ORFVOll基因?qū)Ρ妊芯可形匆?jiàn)報(bào)道。（擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題）本研究通過(guò)對(duì)羊口瘡病毒疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因進(jìn)行克隆測(cè)序，對(duì)國(guó)內(nèi)外不同分離株間ORFVOll基因核苷酸序列、其推導(dǎo)的氨基酸序列和編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

福建省內(nèi)某疑似患羊口瘡的羊唇部痂皮組織利用羊睪丸原代細(xì)胞分離鑒定后，命名為ORFV-PN株。

1.2 試驗(yàn)材料

羊口瘡弱毒疫苗購(gòu)自山東泰豐生物制品有限公司，DH5a感受態(tài)和DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司;限制性內(nèi)切酶BarnHI和SalI購(gòu)自NEB公司;DNAMarker DL2000、DL 5000采購(gòu)自TaKaRa公司;pMC100-M載體購(gòu)自武漢齊美欣科生物技術(shù)有限公司;1-5Hi-Fi DNA polvmerase高保真酶購(gòu)自MCLAB公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)合成

通過(guò)下載GenBank中公布的ORFVOll基因序列（GenBank登錄號(hào)：DQl84476），利用Olig07.0軟件結(jié)合參考文獻(xiàn)[12]設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增ORFVOll基因全長(zhǎng)的特異性引物，在引物兩端添加酶切位點(diǎn)，引物由福州白鯨生物股份有限公司合成。上游引物ORFV011F：5-CGGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTCCA-3;下游引物ORFV011R：5-GCGTCGACTTAATTTATTGGCTTGCAGAACT-3'，劃線部分分別為BamHI和SalI內(nèi)切酶。

1.4 疫苗株與ORFV-PN株病毒DNA的提取和常規(guī)PCR擴(kuò)增

利用全式金病毒DNA/RNA提取試劑盒分別提取疫苗株和ORFV-PN株DNA，凍存于-20℃冰箱。疫苗株和ORFV-PN株P(guān)CR反應(yīng)體系均為40uL：1-5Hi-Fi DNApolymerase 20uL，模板6uL，上、下游引物（10umol·L^-1）各2uL，ddH₂O 10ul.反應(yīng)程序：95℃、3min;95℃、15s，55℃、

15s，72℃、15s，30個(gè)循環(huán);72℃、5min.

1.5 疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因克隆測(cè)序

將凝膠電泳上條帶正確的片段利用膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物與pMCl00-M載體進(jìn)行連接，連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布LB平板，將涂布后的平板放人37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取培養(yǎng)菌質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送往福州尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因核苷酸和氨基酸序列比較

疫苗株和ORFV-PN株測(cè)序結(jié)果利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行比對(duì)，比較兩者在核苷酸和氨基酸水平上的突變情況;同時(shí)將測(cè)序結(jié)果與GenBank上已公布的國(guó)內(nèi)外主要毒株（表1）的ORFVOll基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.7 疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的比較分析

將疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因克隆測(cè)序后正確的核苷酸序列翻譯成氨基酸后分別上傳至在線軟件ProtParam、NCBI-Conserved Domain ArChltcctuIcRetrieval Tool、TMHMM2.0、SignalIP 5.0和NetNGlyc1.0Server中，對(duì)兩者的氨基酸組成和理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、信號(hào)肽及糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析。

1.8 疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的比較分析

利用Lasergene軟件和SOPMA在線軟件對(duì)疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白的親水性、疏水性、抗原指數(shù)、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和β-折疊的占比等進(jìn)行對(duì)比分析。

1.9 疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

分別將疫苗株與ORFV-PN株的ORFVOll基因推導(dǎo)的氨基酸序列上傳至Swiss-Model在線軟件進(jìn)行蛋白3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果運(yùn)用Swiss-PDB-Viewer軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒雙酶切

分別以提取的疫苗株和ORFV-PN株的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在凝膠成像系統(tǒng)下可見(jiàn)疫苗株和ORFV-PN株在1000bp左右有明顯片段，與預(yù)期片段大小相一致（圖1）。將疑膠電泳上條帶正確的片段利用膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收，回收產(chǎn)物與PMC100-M載體進(jìn)行連接，連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布LB平板，LB平板放人37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒用BamHI和Sal I進(jìn)行雙酶切，酶切后得到兩個(gè)片段，一個(gè)約為2300bp，與pMCl00-M大小相等，另一個(gè)片段約為1100bp，與目的片段大小一致（圖2）。

2.2 疫苗株和O～V-PN株ORFV011基因序列測(cè)定分析

將疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因陽(yáng)性質(zhì)粒送往福州尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果利用DNAStar和MEGA7.0軟件進(jìn)行比較分析。測(cè)序結(jié)果顯示：疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因均為1137bp，編碼379個(gè)aa.核苷酸和氨基酸同源性比對(duì)結(jié)果為：疫苗株與ORFV-PN株的核苷酸序列同源性為98.6%;與疫苗株相比，ORFV-PN株共有16處核苷酸差異，分別為32位堿基C突變?yōu)镚，42位堿基C突變?yōu)門(mén)，201位堿基G突變?yōu)锳，238位堿基G突變?yōu)锳，301位堿基G突變?yōu)锳，315位堿基G突變?yōu)锳，367位堿基A突變?yōu)镃，369位堿基A突變?yōu)镃，375位堿基A突變?yōu)镚，636位堿基A突變?yōu)镚，660位堿基G突變?yōu)锳，822位堿基G突變?yōu)锳，840位堿基G突變?yōu)锳，897位堿基C突變?yōu)門(mén)，1044位堿基G突變?yōu)锳，1119位堿基C突變?yōu)門(mén);疫苗株和ORFV-PN株氨基酸序列同源性為98.7%，與疫苗株相比，ORFV-PN株共有5處氨基酸差異，分別為11位氨基酸G突變?yōu)锳，80位氨基酸I突變?yōu)閂，100位氨基酸I突變?yōu)閂，123位氨基酸L突變?yōu)镮，126位氨基酸A突變?yōu)閠.疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因的核苷酸序列和氨基酸序列與國(guó)內(nèi)外毒株的相似性分別為96.9%～99.4%和97.8%～99.1%，其中ORFV-PN株與弱毒株D1701核苷酸和氨基酸序列相似性分別為98.4%和98.7%，可見(jiàn)不同地區(qū)分離株ORFV011基因有一定差異。通過(guò)MEGA7.0構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，本研究中的ORFV-PN株ORFVOll基因氨基酸與新疆毒株KF666565、山西毒株HQ202153同源性最高，同時(shí)與貴州毒株KP994595較接近，處在同一進(jìn)化分支上，與疫苗株和弱毒株D1701相距較遠(yuǎn)（圖3）。

2.3 疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和保守結(jié)構(gòu)域分析

將疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll基因推導(dǎo)的氨基酸序列分別上傳至Expasy在線軟件進(jìn)行分析，從分析結(jié)果可知，疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別為41.67和41.69kDa，理論等電點(diǎn)均為6.01;ORFV-PN株脂肪族氨基酸指數(shù)和親水性指數(shù)與疫苗株相比均變小。利用TMHMM2.0在線軟件和SignalP 5.0在線分析結(jié)果顯示，疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白均無(wú)跨膜區(qū)和信號(hào)肽。利用NetNGlYc 1.0Server在線軟件對(duì)疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白進(jìn)行糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示均有4個(gè)糖基化位點(diǎn)，沒(méi)有發(fā)生變化。經(jīng)NCBI-Conserved Domain Architecture Retrieval Tool在線分析疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白的保守性結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白均含有2個(gè)磷脂酶D超家族的保守結(jié)構(gòu)域以及對(duì)應(yīng)的特異性結(jié)合位點(diǎn)。

2.4 疫苗株和ORFV-PN株ORFVOll蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)及功能分析

通過(guò)Lasergene軟件中Protean程序?qū)σ呙缰旰蚈RFV-PN株ORFV011蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4）顯示：疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白抗原位點(diǎn)均分布在60～120、160～180、200～220、260～279位氨基酸，具有較好的柔韌性，前3個(gè)抗原可及性較高。由表2可知，疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中。α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲較多，其中ORFV-PN株。α-螺旋比疫苗株多14個(gè)，β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲比疫苗株分別少3個(gè)、7個(gè)和4個(gè)。通過(guò)Swiss-Model在線軟件提交疫苗株與ORFV-PN株ORFV01l蛋白序列進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，從造模結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與磷酸酯酶D（PhosphollpaseD）結(jié)構(gòu)相似性最高，與蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果相同。由圖5（箭頭所指位置）可以看出，疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白的三維結(jié)構(gòu)有一定的差異，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，具體體現(xiàn)在無(wú)規(guī)則卷曲的程度和α-螺旋的長(zhǎng)度上。

3 討論

疫苗接種是控制傳染病發(fā)生的有效手段之一。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)羊口瘡的預(yù)防主要是通過(guò)接種弱毒苗。然而，由于羊口瘡病毒弱毒苗接種方法的特殊性，以及各地使用疫苗免疫后效果不理想，出現(xiàn)免疫失敗和重復(fù)感染，近年來(lái)出現(xiàn)了關(guān)于羊口瘡病毒弱毒苗是否能夠提供有效保護(hù)的疑惑。

據(jù)報(bào)道，ORFVOll基因編碼約42kDa的蛋白具有良好的免疫原性，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)。此外ORFVOll基因常被用作遺傳進(jìn)化樹(shù)分析，是作為羊口瘡病毒分子流行病學(xué)研究的參考對(duì)象之一。對(duì)福建省地方株和疫苗株ORFVOll基因的分子特征及蛋白結(jié)構(gòu)的比較分析，可為福建省羊口瘡的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及疫苗選擇提供理論依據(jù)，同時(shí)有助于闡明羊口瘡病毒的致病機(jī)制。

本研究通過(guò)對(duì)市面上購(gòu)買(mǎi)的商品化羊口瘡病毒疫苗弱毒株和福建省ORFV-PN株提取DNA，利用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增ORFVOll全基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，轉(zhuǎn)化至基因工程菌中，將陽(yáng)性克隆子送生物技術(shù)公司測(cè)序，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)序后的核苷酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。核苷酸序列和氨基酸序列相似性比較顯示，ORFV-PN與疫苗株和弱毒株D1701株ORFVOll基因核苷酸序列相似性分別為98.6%和98.4%，氨基酸序列相似性均為98.7%，與疫苗株相比，ORFV-PN株共有16處核苷酸變異和5處氨基酸變異，該結(jié)果與李智、E1-Tholoth、ZHANG等研究結(jié)果一致。在蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)上，疫苗株和ORFV-PN株ORFV01l蛋白均有4個(gè)糖基化位點(diǎn)，位點(diǎn)未發(fā)生轉(zhuǎn)移或突變;兩者均無(wú)信號(hào)肽，表明ORFV01l為非分泌蛋白;親水性區(qū)域和理論等電點(diǎn)均相同，但相對(duì)分子質(zhì)量卻不同，這與氨基酸的點(diǎn)位突變有關(guān)。在蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)上，ORFV-PN株和疫苗株的抗原位點(diǎn)差異甚小，但在α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和β-折疊數(shù)量上存在一定的差異，ORFV-PN株和疫苗株。α-螺旋占比分別為34.13%和30.42%，β-轉(zhuǎn)角占比分別為6.08%和6.88%，無(wú)規(guī)則卷曲占比分別為37.3%和39.15%，β-折疊占比分別為22.49%和23.54%;蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)上ORFV-PN株預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)與疫苗株的三維結(jié)構(gòu)在α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲上有一定的差異，三級(jí)結(jié)構(gòu)上的差異與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相一致。

本研究運(yùn)用多種生物信息學(xué)軟件對(duì)羊口瘡病毒疫苗株和福建ORFV-PN株ORFVOll基因及編碼的蛋白在分子特征以及蛋白結(jié)構(gòu)功能方面進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，福建省羊口瘡病毒已出現(xiàn)一定的變異，應(yīng)當(dāng)引起廣大獸醫(yī)工作者和有關(guān)部門(mén)的重視，加強(qiáng)對(duì)羊口瘡的監(jiān)控。