外源褪黑素對鹽脅迫下香椿種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

劉珂　張嘉欣　杜清潔　劉珂珂　馬勇斌　丁新新　肖懷娟

摘 要： 為探究褪黑素對鹽脅迫環(huán)境下香椿（Toona sinensis）種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，以香椿為試材，采用清水處理為對照，利用NaCl模擬鹽脅迫環(huán)境，分別用0、50、100、200、300 ?mol·L-1的褪黑素處理香椿種子及幼苗，測定種子萌發(fā)后的各項生理指標(biāo)。結(jié)果表明，鹽脅迫處理顯著抑制了香椿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和根長，以及幼苗葉片的葉長、葉寬。與鹽脅迫處理相比，100 ?mol·L-1褪黑素預(yù)處理的香椿種子萌發(fā)和幼苗生長均得到顯著改善，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)分別顯著提高了15.56%、18.89%、12.21%，葉長和葉寬提高了9.26、10.10 mm。鹽脅迫導(dǎo)致香椿幼苗丙二醛含量和過氧化物酶活性顯著高于對照，而超氧化物歧化酶活性顯著低于對照。低濃度褪黑素預(yù)處理則顯著降低了鹽脅迫下丙二醛含量和過氧化物酶活性，提高了超氧化物酶活性。其中，提高香椿幼苗耐鹽性的最適褪黑素濃度為100 ?mol·L-1，與鹽脅迫相比，丙二醛含量和過氧化物酶活性分別降低了6.19 ?mol·g-1、 6 292.57 U·g-1，超氧化物酶活性提高了22.16 U·g-1。

關(guān)鍵詞： 香椿;褪黑素;鹽脅迫;萌發(fā);生長

中圖分類號：S644.4? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? 文章編號：1673-2871（2020）05-053-06

Abstract： To explore the effect of melatonin on seed germination and seedling growth of Toona sinensis under salt stress. Toona sinensis was used as the test material， NaCl was used to simulate salt environment. Toona sinensis seeds and seedlings were treated with 0， 50， 100， 200 and 300 ?mol·L-1 melatonin， respectively， and water treatment was used as control. The root length， germination rate， germination potential， germination index， leaf length， leaf width， chlorophyll content， superoxide dismutase， peroxidase and malondialdehyde were measured. The results showed that the germination rate， germination potential， germination index， root length， the leaf length and the leaf width of seedling leaves were significantly inhibited by salt stress. Compared with salt stress treatment， seed germination and seedling growth of Toona sinensis were significantly improved after 100 ?mol·L-1 melatonin pretreatment， germination rate， germination potential， germination index， leaf length， leaf width were significantely improved 15.56%， 18.89%， 12.21%， 9.26 mm and 10.10 mm， respectively. Under salt stress， malondialdehyde content and peroxidase activity in Toona sinensis seedlings were significantly higher than those of control， while superoxide dismutase activity was significantly lower than that of the control. Malondialdehyde content and peroxidase activity under salt stress were significantly reduced by low concentration of melatonin pretreatment， while superoxide activity was increased. The optimum melatonin concentration to improve the salt tolerance of Toona sinensis seedlings was 100 ?mol·L-1， compared with salt stress treatment， the decrease of peroxidase activity and malondialdehyde were reduced 6.19 ?mol·g-1， 6 292.57 U·g-1， respectively， and superoxide dismutase was increased 22.16 U·g-1.

Key words： Toona sinensis; Melatonin; Salt stress; Germination; Growth

香椿（Toona sinensis）為楝科香椿屬植物，原產(chǎn)中國，以食用嫩芽為主。香椿芽具有較高的營養(yǎng)價值，并且風(fēng)味獨特，散發(fā)一股濃郁香氣，可以增強人的食欲。隨著人們對身體健康的重視，香椿也成為高營養(yǎng)價值蔬菜的典型代表[1]。近年來，各地利用種子繁殖來實現(xiàn)香椿生產(chǎn)[2]。但由于栽培過程中化肥的過度使用和保護(hù)地栽培中土壤缺乏雨水沖刷等多方面原因，造成土壤鹽漬化現(xiàn)象越來越多，已嚴(yán)重制約了香椿芽苗和成樹生產(chǎn)的規(guī)模。因此，進(jìn)行香椿種子及香椿幼苗的耐鹽生理研究，對擴(kuò)張香椿種植面積、有效利用鹽漬化土壤和實現(xiàn)香椿高產(chǎn)有重大意義。

土壤中可溶性鹽濃度過大，一方面會造成土壤水勢過低，低于細(xì)胞水勢時發(fā)生植物組織水分外滲，引起植物生理性缺水，另一方面由于單一離子含量較高，會產(chǎn)生單鹽毒害并且影響植物對其他元素的吸收，最終導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)的自由基代謝動態(tài)平衡被打破，活性氧（ROS）增加，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，選擇透性喪失，有毒物質(zhì)積累，植物代謝紊亂，影響植物的生長發(fā)育[3-5]。姚俠妹等[4]用不同濃度的NaCl處理香椿幼苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著 NaCl 濃度提高，香椿幼苗葉長、葉寬和株高呈降低趨勢，且影響香椿的光合作用，進(jìn)而影響了香椿幼苗的生長。

褪黑素（MT）是廣泛存在于動植物體內(nèi)的一種低分子量（232.27）吲哚胺類化合物，1958年被LERNER在牛的松果體中首次提取出來[6]。MT作用于植物體的整個生長發(fā)育階段，可以調(diào)控植物的營養(yǎng)器官和生殖器官發(fā)育以及調(diào)控光合效率和葉片衰老，除此之外，MT還可以增強植物對冷熱脅迫、滲透脅迫、氧化脅迫、病菌脅迫的耐受性[7]。唐懿等[8]研究表明，MT可以提高低溫弱光脅迫下茄子幼苗葉片的葉綠素含量，提高過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性，降低丙二醛（MDA）的含量，促進(jìn)可溶性糖積累，提高茄子幼苗葉片對低溫弱光脅迫的抵抗力等。目前，MT對大豆、茄子、蘋果、水稻、紫蘇、獼猴桃等[3，8-13]已有研究，鮮見MT對香椿的相關(guān)研究報道。因此，筆者以香椿為試材，采用種子階段前期MT浸泡處理，幼苗階段采用外源噴施MT預(yù)處理，測定鹽脅迫下香椿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和香椿幼苗葉片的抗氧化酶活性等指標(biāo)，探討MT在香椿抵抗鹽脅迫方面的生理機(jī)制，篩選出適宜的MT濃度，旨在為香椿栽培中利用MT提高作物耐鹽性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

香椿材料為‘紅油香椿，產(chǎn)自燕山山脈地區(qū)，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院設(shè)施蔬菜栽培課題組提供;凹形定植棉規(guī)格為2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm，水培槽規(guī)格為44 cm×28 cm×5 cm。試驗于2019年2月27日至4月13日在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院設(shè)施蔬菜實驗室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 種子處理及萌發(fā)試驗 挑選籽粒飽滿、大小一致的香椿種子用75%的酒精溶液消毒30 s后，無菌水沖洗3次，每次2 min。室內(nèi)回干到種子初始含水量。回干后的種子浸泡在MT溶液中進(jìn)行預(yù)處理。MT溶液濃度分別為0、50、100、200、300 ?mol·L-1（分別為處理A、B、C、D、E），浸泡時間為12 h。再次在室內(nèi)回干到種子原始含水量，在直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中放2層無菌濾紙，每皿添加5 mL的100 mmol·L-1 NaCl溶液為發(fā)芽溶液。對照（CK）采用清水對種子進(jìn)行預(yù)處理，過程同其他處理，且以清水為發(fā)芽溶液。種子在人工氣候室（RLD-380E-4）中進(jìn)行萌發(fā)，培養(yǎng)條件為溫度20 ℃，相對濕度70%，黑暗培養(yǎng)。采用完全隨機(jī)處理，每個處理3次重復(fù)，每重復(fù)為30粒種子。培養(yǎng)期間每隔3 d補充發(fā)芽溶液1 mL。

為選擇適宜鹽濃度的發(fā)芽溶液，首先進(jìn)行鹽處理試驗，將未被MT溶液處理過的香椿種子在不同濃度（0、50、100、200、300 mmol·L-1）NaCl溶液中進(jìn)行發(fā)芽，測定種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，最后選定剛好能夠抑制香椿種子萌發(fā)的鹽脅迫處理濃度為100 mmol·L-1 。

1.2.2 發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和芽長的測定 在處理第5天統(tǒng)計各處理的發(fā)芽數(shù)，計算發(fā)芽勢。處理第10天統(tǒng)計各處理的發(fā)芽數(shù)，計算發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)。用20 cm直尺測量種子處理10 d后的芽長。發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的計算參照李平平等[2]的方法。

1.2.3 幼苗培養(yǎng)及處理 挑選籽粒飽滿、大小一致的香椿種子，溫湯浸種后放入直徑為150 mm的培養(yǎng)皿中（放2層無菌濾紙），每皿添加10 mL的蒸餾水，在溫度20 ℃、相對濕度70%的光照培養(yǎng)箱暗光培養(yǎng)中催芽。待種子露白達(dá)80%后播于凹形定植棉中進(jìn)行水培培養(yǎng)。待香椿幼苗子葉展平后從培養(yǎng)箱中取出，使用水培槽進(jìn)行水培，放在人工氣候室培養(yǎng)。環(huán)境條件設(shè)置：晝/夜光周期為16 h/8 h，光強為10 000 lx，晝/夜溫度為23 ℃/18 ℃。

待幼苗2葉1心時，隨機(jī)選取120株幼苗平均分為5組，各噴施0、50、100、200、300 μmol·L-1的外源MT（分別為處理A、B、C、D、E），連續(xù)噴施3 d，然后在營養(yǎng)液中添加100 mmol·L-1的NaCl。采用噴施清水+正常營養(yǎng)液作為對照（CK）。添加NaCl 7 d后，測定各項指標(biāo)。試驗設(shè)計為完全隨機(jī)處理，每個處理設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)24株。

1.2.4 形態(tài)指標(biāo)的測定 鹽脅迫處理7 d后，各處理隨機(jī)選取3株植株，用數(shù)顯游標(biāo)卡尺（DL91150）測量植株葉片的長和寬。

1.2.5 生理指標(biāo)的測定 鹽脅迫處理7 d后取樣測量葉綠素等生理指標(biāo)。其中，葉綠素含量采用無水乙醇與丙酮混合法測定[14];超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）的活性與丙二醛（MDA）含量采用張海波[15]的方法測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 24.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用LSD法對比各處理間差異。

2 結(jié)果分析

2.1 不同濃度MT對香椿種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢的影響

由圖1可知，與CK相比，鹽脅迫處理下香椿種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著降低，MT預(yù)處理可顯著緩解鹽脅迫處理對發(fā)芽率和發(fā)芽勢的抑制作用。鹽脅迫處理下，處理B～E（50、100、200、300 ?mol·L-1 MT預(yù)處理）的種子發(fā)芽率分別比處理A（無MT預(yù)處理）增加了8.89%、15.56%、15.56%、15.56%，均與CK無顯著差異（圖1-A）。同時，處理B～E使鹽脅迫下種子發(fā)芽勢（圖1-B）由處理A的5.56%分別顯著提高到了22.22%、24.45%、14.44%、15.56%。這說明MT預(yù)處理可顯著提高鹽脅迫下香椿種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，其中50和100 ?mol·L-1的MT預(yù)處理效果最佳。

2.2 不同濃度MT對香椿種子發(fā)芽指數(shù)的影響

由圖2可知，鹽脅迫下處理A香椿種子的發(fā)芽指數(shù)較CK降低了81.47%，達(dá)顯著水平。鹽脅迫處理下，與無MT預(yù)處理相比，MT預(yù)處理均大幅促進(jìn)了種子的發(fā)芽指數(shù)，其中，處理C（100 ?mol·L-1 MT預(yù)處理）的發(fā)芽指數(shù)最高，達(dá)到CK的57.52%，其次為處理B、D、E，分別為CK的53.49%、52.47%、51.52%。

2.3 不同濃度MT對香椿種子芽長的影響

由圖3可以看出，鹽脅迫處理也顯著抑制了香椿種子的芽伸長。同鹽脅迫下無MT預(yù)處理（處理A）相比，香椿種子的芽長在MT預(yù)處理下顯著增大，其中，處理B～D之間無顯著差異，且顯著高于處理E。說明低濃度MT預(yù)處理能顯著緩解鹽脅迫對香椿種子芽伸長的抑制作用，但高濃度MT的緩解效果較差。

2.4 不同濃度MT對香椿幼苗葉長和葉寬的影響

由圖4可以看出，鹽脅迫明顯抑制了香椿幼苗植株的長勢，MT預(yù)處理可以在不同程度上緩解鹽脅迫對幼苗長勢的抑制。香椿幼苗葉長和葉寬均以鹽脅迫處理（處理A）下最小，顯著低于CK;以處理C（100 ?mol·L-1 MT預(yù)處理）最大，分別為處理A的1.28倍和1.37倍，且顯著高于CK;處理D（200 ?mol·L-1 MT預(yù)處理）均顯著高于鹽脅迫處理，但葉寬與CK無顯著差異;處理B（50 ?mol·L-1 MT預(yù)處理）均顯著高于鹽脅迫處理，且顯著低于CK;處理E（300 ?mol·L-1 MT預(yù)處理）均顯著高于鹽脅迫處理，且顯著低于CK。表明50、100 和200 ?mol·L-1 MT預(yù)處理都對緩解鹽脅迫下香椿幼苗葉片長度和寬度作用顯著，其中100 ?mol·L-1 MT預(yù)處理的效果最好。

2.5 不同濃度MT對香椿幼苗葉綠素含量和MDA含量的影響

由圖5-A可以看出，各處理間香椿幼苗葉綠素含量無顯著差異，表明鹽脅迫和MT預(yù)處理均不影響香椿幼苗的葉綠素代謝。由圖5-B可以看出，與CK相比，鹽脅迫處理下MDA含量大幅升高，為CK的1.55倍。MT預(yù)處理均使MDA含量較鹽脅迫處理顯著下降，但處理B、處理D和處理E（50、200、300 ?mol·L-1 MT預(yù)處理）的MDA含量顯著高于CK，處理C（100 ?mol·L-1 MT預(yù)處理）的MDA含量則顯著低于CK。表明MT預(yù)處理均能緩解鹽脅迫下香椿幼苗MDA的積累，其中100 ?mol·L-1 MT預(yù)處理的作用最好。

2.6 不同濃度MT對香椿幼苗POD和SOD含量的影響

由圖6-A可知，鹽脅迫處理下POD活性為CK的1.65倍，差異達(dá)顯著水平。MT預(yù)處理則不同程度地抑制鹽脅迫下POD活性的升高。與鹽脅迫處理相比，處理B～E的POD活性分別降低了30.37%、43.82%、36.89%和34.17%。由圖6-B可知，香椿幼苗SOD活性在鹽脅迫下較CK顯著下降。處理B和處理C（50和100 ?mol·L-1 MT預(yù)處理）可顯著緩解SOD活性的降低。與鹽脅迫相比，處理D和處理E（200和300 ?mol·L-1 MT預(yù)處理）的SOD活性有所下降，其中處理E的SOD活性與鹽脅迫的差異顯著。上述結(jié)果表明，MT可抑制香椿幼苗的POD活性;低濃度的MT可促進(jìn)SOD活性的增加，高濃度的反而抑制SOD的活性。

3 討論與結(jié)論

土壤中鹽離子含量對植物生長、發(fā)育和產(chǎn)量形成具有很大影響，過高的鹽含量可破環(huán)植物體內(nèi)的新陳代謝過程。MT作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑，對植物的生長發(fā)育有重要調(diào)節(jié)作用，研究MT對鹽脅迫下植物種子萌發(fā)及幼苗生長的影響是非常重要的。前人研究結(jié)果表明，MT預(yù)處理可顯著緩解鹽脅迫對黃瓜、玉米和棉花種子的抑制作用[16-18]。本研究結(jié)果也表明，在鹽脅迫下MT預(yù)處理過的香椿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和根長均較無MT預(yù)處理的有所提高，且100 ?mol·L-1 MT預(yù)處理下各指標(biāo)均達(dá)顯著水平。張海軍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素處理能夠明顯提高氯化鈉脅迫下黃瓜種子中SOD、POD和CAT活性，清除活性氧，降低膜質(zhì)過氧化程度，從而緩解鹽脅迫對種子造成的抑制作用。轉(zhuǎn)錄組和miRNA組證據(jù)也表明，MT預(yù)處理能顯著提高鹽脅迫下玉米種子的萌發(fā)過程中POD、CAT、SOD等抗氧化酶的表達(dá)[17]。

筆者發(fā)現(xiàn)，MT預(yù)處理可緩解鹽脅迫對香椿幼苗長勢的抑制作用，降低鹽脅迫下香椿幼苗葉片脂質(zhì)過氧化物MDA的積累。Mittler[19]指出，高等植物在受到氧化脅迫時，會自身形成一套主要包括SOD、POD、CAT和APX等酶促系統(tǒng)的完整抗氧化體系鏈條。本研究中，低濃度MT預(yù)處理可提高幼苗葉片中SOD活性。SOD可清除植物體內(nèi)的超氧陰離子，使植物體內(nèi)的活性氧含量減少。因此，MT可通過調(diào)控SOD活性來減緩鹽脅迫下膜脂過氧化對香椿細(xì)胞的傷害，促進(jìn)香椿幼苗的生長，與前人研究結(jié)果一致[13， 20-21]。POD作為一個重要的抗氧化酶，可清除細(xì)胞內(nèi)ROS，但同時也參與木質(zhì)素的合成，增加木質(zhì)化程度，可以作為組織老化的一種生理指標(biāo)[22-23]。本研究中MT預(yù)處理后的香椿幼苗在鹽脅迫下的POD活性顯著降低，以100 ?mol·L-1 MT預(yù)處理下降低幅度最大。這表明MT預(yù)處理主要通過提高香椿幼苗葉片中SOD的活性來清除鹽脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，減緩了組織老化進(jìn)程。

綜上所述，鹽脅迫下香椿種子的萌發(fā)以及幼苗的生長受到抑制，MT可有效緩解鹽脅迫對香椿種子和幼苗的損害。MT濃度為100 μmol·L-1時效果最好，為后續(xù)香椿種子萌發(fā)和幼苗生長的進(jìn)一步研究提供理論參考和技術(shù)支持。

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