高效液相色譜法測定口腔清潔用品中11種防腐劑含量

吳智慧，楊 銘

(浙江方圓檢測集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州 310018)

口腔清潔用品是常見的日用消費(fèi)品，主要包括牙膏、漱口水、牙粉等?？谇磺鍧嵱闷分刑砑拥姆栏瘎┲饕糜谝种莆⑸锏纳L，保證產(chǎn)品在使用周期的質(zhì)量安全。由于口腔清潔產(chǎn)品直接作用于口腔，其中防腐劑的種類和含量決定了其對人身健康的影響，因此亟需對口腔清潔用品中防腐劑含量開展檢測研究。

口腔清潔用品中添加的防腐劑有：酸性防腐劑(包括苯甲酸、山梨酸和丙酸以及它們的鹽類等)，酯類防腐劑(包括對羥基苯甲酸酯類(尼泊金酯類)、沒食子酸酯、抗壞血酸棕櫚酸酯等)，新型合成防腐劑(α-(2-羥基乙胺)-β-苯甲酰丙酸乙酯鹽酸鹽)，新型天然防腐劑(溶菌酶，中草藥類，介子提取物等)。新型防腐劑目前尚未普及使用，傳統(tǒng)防腐劑仍是市場主流，因此本文重點(diǎn)研究11種常見的口腔清潔用品傳統(tǒng)防腐劑。

目前防腐劑的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)、分光光度法、薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)等。氣相色譜法選擇性高，可分離性能相近物質(zhì)和多組分混合物，分析速度快，但是不能直接定性；分光光度法使用過程中幾乎不損耗儀器，節(jié)約成本，靈敏度高，但是專屬性不強(qiáng)，受外界的影響大，誤差相對較大；薄層色譜法檢測設(shè)備簡單，操作方便，但是重復(fù)性不好；高效液相色譜法，靈敏度高可測定痕量物質(zhì)，準(zhǔn)確性好，分辨率高于其他色譜法，可通過光譜圖對比定性，是目前比較好的防腐劑檢測方法。國內(nèi)已有部分關(guān)于口腔清潔用品中個(gè)別防腐劑種類檢測的報(bào)道[1-2]，但是罕見對口腔清潔用品中多種防腐劑檢測方法的研究。按照口腔用品的現(xiàn)狀及未來發(fā)展趨勢，單一防腐劑體系將逐漸被幾種防腐劑復(fù)配形成廣譜高效的協(xié)同增效防腐體系所取代[3]。因此本文選擇采用高效液相色譜法對口腔清潔用品中的11種常見防腐劑的檢測技術(shù)進(jìn)行研究。通過對樣品前處理及儀器分析條件的優(yōu)化，建立一條高效、簡便、環(huán)保、準(zhǔn)確度高的口腔清潔用品中防腐劑含量的測定方法。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

儀器：安捷倫-1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；KQ-100DB超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；xs204電子天平，梅特勒托利多有限公司；SHZ-Ⅲ真空抽濾裝置，上海亞榮生化儀器廠；FE28型pH計(jì)，梅特勒托利多有限公司；Milli-Q純水儀，Millipore公司。

試劑：甲醇、乙腈、磷酸、氫氟酸、氫氧化鈉，色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉、氯化十六烷三甲胺，優(yōu)級純，無錫市展望化工試劑有限公司；甲基異噻唑啉酮、甲基氯異噻唑啉酮、苯甲酸、苯甲醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸丁酯、對羥基苯甲酸異丁酯、對羥基苯甲酸乙酯，標(biāo)準(zhǔn)品，Dr.Ehrenstorfer；沒食子酸(標(biāo)準(zhǔn)品)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：ACE Excel C185微米 250×4.6 mm i.d.；流動(dòng)相：甲醇+乙腈+磷酸二氫鈉=35+15+50(v/v/v)；流速1.5 mL/min；波長：甲基氯異噻唑啉酮，沒食子酸和甲基異噻唑啉酮在280 nm 檢測；其他組分在254 nm處檢測；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：5.0微升。

1.3 樣品前處理

稱1.0 g樣品于25.0 mL比色管中，用50%甲醇的水溶液稀釋至刻度，在30 ℃水浴情況下超聲振蕩30 min，取上清液用0.45微米微孔過濾，濾液供測定用。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

在不同檢測波長下，各種類防腐劑的紫外吸收程度不同。將11種防腐劑分別進(jìn)樣分析，得到各防腐劑的紫外吸收光譜圖，觀察比較后可得，在波長254 nm處大部分防腐劑均有較強(qiáng)吸收，在波長280 nm處沒食子酸、甲基異噻唑啉酮和甲基氯異噻唑啉酮均有較強(qiáng)吸收。因此選擇254 nm以及280 nm為最佳的檢測波長。

2.2 流動(dòng)相選擇

2.2.1 流動(dòng)相配比

高效液相色譜法同時(shí)測定化妝品中多種防腐劑已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，大多選擇甲醇+乙腈+磷酸二氫鈉作為流動(dòng)相。本實(shí)驗(yàn)為得到較好的分離度以及較快的分析時(shí)間，嘗試了不同的流動(dòng)相配比。

表1 流動(dòng)相配比Table 1 Flow matching ratio

結(jié)果表明，流動(dòng)相配比采用方法2時(shí)，雖然峰分離程度好，但是出峰整體時(shí)間變長。流動(dòng)相配比使用方法3時(shí)，色譜峰存在重疊現(xiàn)象，不能完全分離。在使用方法4，色譜峰未能全部顯示。而流動(dòng)相采用方法5，峰型雜亂，分離度差，無法有效分離。采用了方法1：甲醇+乙腈+磷酸二氫鈉=35+15+50(v/v/v)作流動(dòng)相時(shí)，色譜峰完全基線分離，且峰型良好，得到最佳分離效果。

2.2.2 流動(dòng)相pH

11種防腐劑中含有酸性基團(tuán)，為抑制解離，流動(dòng)相應(yīng)為酸性。綜合考慮ACE Excel 5 C18色譜柱的最佳使用條件，流動(dòng)相調(diào)試范圍采用3.5≤pH<7。

磷酸二氫鈉溶液配制成pH=3.5，pH=4，pH=4.5三種。pH=4.5時(shí)，pH對出峰情況有顯著影響，無法正常識別。pH=4時(shí)沒食子酸和甲基氯異唑啉酮兩者的色譜峰保留時(shí)間相接近，分離度差，無法有效分離。因此pH選擇3.5。

2.3 柱溫選擇

初始柱溫升高的同時(shí)理論塔板數(shù)呈線性下降。進(jìn)樣口溫度和初始柱溫溫差越大，待測物越容易冷凝在色譜柱頭，其初始色譜帶沿柱軸方向展開越小分離能力越強(qiáng)[4]。但是在實(shí)際應(yīng)用中要綜合考慮分析時(shí)間是否適中，色譜峰是否分離良好。本實(shí)驗(yàn)觀察分離效果發(fā)現(xiàn)，柱溫對分離效果的影響并不顯著，當(dāng)色譜柱柱溫為25 ℃時(shí)分離效果最為顯著。因此選擇25 ℃為最優(yōu)色譜柱柱溫。

2.4 儀器參數(shù)優(yōu)化后11種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)譜圖

當(dāng)采用ACE Excel C185 μm, 250×4.6 mm色譜柱、甲醇+乙腈+磷酸二氫鈉=35+15+50(v/v/v)、流速 1.5 mL/min、柱溫25 ℃的儀器參數(shù)時(shí)，能實(shí)現(xiàn)11種防腐劑色譜峰峰形良好，分離完全。在最優(yōu)色譜條件下，得到11種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)譜圖如圖1所示。

圖1 采用方法1流動(dòng)相配比得到的11種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)譜圖Fig.1 Standard spectrograms of 11 preservatives obtained by flow matching method 1

2.5 防腐劑提取條件優(yōu)化

2.5.1 提取劑的選擇

市場所售牙膏中，主要摩擦劑為水合硅石(二氧化硅)，少部分含有碳酸鈣和磷酸氫鈣[5]。擬采取破壞主體摩擦劑，提取樣品的目的，在相同提取條件下各采用4種溶劑提取，見表2、表3。

水合硅石類提取劑：純水，甲醇，50%甲醇水溶液，5%氫氟酸50%甲醇水溶液。碳酸鈣類提取劑：純水，甲醇，50%甲醇水溶液，5%磷酸50%甲醇水溶液。磷酸氫鈣類提取劑：純水，甲醇，50%甲醇水溶液，5%氫氧化鈉50%甲醇水溶液。

表2 水合硅石類口腔清潔用品中防腐劑的提取條件Table 2 Extraction conditions of preservatives in hydrated silica oral cleaning products

表3 不同提取條件下各目標(biāo)物質(zhì)的提取效果 Table 3 Extraction effect of each target substance under different extraction conditions (%)

以水合硅石基質(zhì)為例，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取劑為純水時(shí)，加標(biāo)樣品中防腐劑未能得到充分提取。提取劑為甲醇時(shí)，由于樣品溶解部分過少，出峰情況不樂觀。當(dāng)目的是破壞主體摩擦劑時(shí)，由于過強(qiáng)的酸堿性會損壞儀器，故選用的提取劑所添加酸堿濃度較低。此時(shí)操作成本上升且不能達(dá)到較好的提取效果。重復(fù)上述步驟進(jìn)行碳酸鈣類基質(zhì)和磷酸氫鈣類基質(zhì)提取劑的測定，均符合上述規(guī)律。綜上，選擇50%甲醇水溶液為本次實(shí)驗(yàn)提取劑。

2.5.2 超聲時(shí)間

以50%甲醇的水溶液為提取溶劑，1.0 g加標(biāo)樣品在25 ℃下超聲提取10、20、30、40、50 min后，過0.45 μm混合膜，上機(jī)分析。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在前30 min內(nèi)提取效果隨著時(shí)間增加而顯著提高，30 min后，提取效果變化不顯著。

2.5.3 超聲溫度

50%甲醇的水溶液為提取溶劑，1.0 g加標(biāo)樣品在20、25、30、40、50 ℃下超聲提取30 min后，過0.45 μm混合膜，上機(jī)分析。30 ℃時(shí)各特征峰峰型良好，分離完全。因此選用30 ℃為最佳超聲提取溫度。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

表4 11種防腐劑的檢出限、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)表Table 4 Detection limit, linear regression equation and correlation coefficient of 11 preservatives

將配制好的5，10，20，50，100，200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在最優(yōu)的色譜條件下進(jìn)行高效液相色譜分析，得到11種防腐劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線。再分別以3倍信噪比(S/N=3)來計(jì)算檢出限。結(jié)果表明，11種目標(biāo)物質(zhì)在5～200 μg/L 范圍內(nèi)線性良好，各相關(guān)系數(shù)在0.999以上，見表4。

2.7 方法精密度和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行方法的精密度和回收率測定實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)通過往空白樣品中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以3個(gè)濃度水平1、10、20 mg/L，按照色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)濃度進(jìn)行6次重復(fù)進(jìn)樣，測出平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)，見表5。由表5可知，11種防腐劑的加標(biāo)回收率在91.81%～101.70%之間，RSD在0.08%～3.3%之間。

表5 空白樣品的加標(biāo)回收率和精密度表Table 5 Standard addition recovery and precision of blank sample

2.8 樣品分析

按試驗(yàn)方法對從市場上隨機(jī)采購的不同品牌的10批次口腔清潔用品，包括6批次牙膏，2批次牙粉，2 批次漱口水，試驗(yàn)結(jié)果表明，有1批次牙粉中檢出苯甲醇，含量為355.4 μg/g，其

外包裝上也標(biāo)明含有苯甲醇。其余9批次產(chǎn)品中此11種防腐劑未檢出。

3 結(jié) 論

本文研究了不同的流動(dòng)相配比及提取劑選擇，并對高效液相色譜儀測定參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，得到的優(yōu)化方法是：樣品采用50%甲醇超聲提取，色譜柱ACE Excel C185微米 250×4.6 mm、甲醇+乙腈+磷酸二氫鈉=35+15+50(v/v/v)、流速1.5 mL/min、柱溫25 ℃，254 nm以及280 nm測定波長，流動(dòng)相pH 3.5，超聲溫度30 ℃，時(shí)間30 min。本方法操作簡單，成本低，可應(yīng)用于口腔清潔產(chǎn)品中11種防腐劑同時(shí)測定，填補(bǔ)口腔清潔產(chǎn)品領(lǐng)域多種防腐劑檢測的空白，也為政府部門的監(jiān)管提供技術(shù)支持。