響應面優(yōu)化酶解法制備巖豆抗氧化肽工藝

屠瀚超，陽曉晶，羅松明

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 食品學院,四川 雅安 625014； 2.千禾味業(yè)食品股份有限公司，四川 眉山 620010)

巖豆(MillettiadielsianaHarms ex Diels)是香花崖豆藤(MillettiadielsianaHarms)的種子。香花崖豆藤是豆科崖豆藤屬的植物，為攀緣藤本或木本植物，多以藤莖入藥，其中藥名為昆明雞血藤。香花崖豆藤主要分布于我國四川、貴州、云南等地，在四川萬源、長寧等地有大規(guī)模種植[1]。巖豆中的蛋白質含量豐富，且不含膽固醇，可以提高食品營養(yǎng)價值，預防心血管疾病[2]。

目前國內(nèi)外對巖豆方面的成分開發(fā)利用研究較少，主要集中在香花崖豆藤的化學成分[3-5]、巖豆凝集素[6-7]等方面，對巖豆抗氧化肽的研究幾乎沒有。利用蛋白酶酶解蛋白質制得活性肽具有反應條件溫和、省時高效的優(yōu)點[8]，還可以很好地保留小肽的營養(yǎng)價值，甚至可以去除部分致敏原[9]，同時制得的多肽具有較好的抗氧化活性，是當前大規(guī)模制備抗氧化活性肽的主要手段。目前利用響應面優(yōu)化并結合酶解法制備巖豆抗氧化肽工藝的研究鮮見報道。本研究在單因素試驗的基礎上，通過響應面法優(yōu)化巖豆鹽溶蛋白酶解制備抗氧化肽的工藝條件，為研究巖豆抗氧化肽的活性、分離純化及生產(chǎn)提供一定的依據(jù)，以提高巖豆的綜合利用水平及產(chǎn)業(yè)附加值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

巖豆，采購于四川省達州市萬源縣。

胃蛋白酶(酶活力3 000 U/g)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，索萊寶生物公司；木瓜蛋白酶(酶活力300 000 U/g)、中性蛋白酶(酶活力50 000 U/g)、菠蘿蛋白酶(酶活力800 000 U/g)，上海瑞永科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

Milli-Q Reference 超純水裝置，美國 Millipore 公司；UV-2802紫外可見分光光度計；PHS-3C pH 計；D-37520高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 巖豆鹽溶蛋白提取工藝

巖豆→去皮→粉碎→石油醚脫脂10 h→加入0.1 mol/L的NaCl溶液(料液比1∶50)→磁力攪拌30 min(恒溫38℃)→離心(8 000 r/min, 15 min)→取上清液→調節(jié)pH至4.3→離心(8 000 r/min，15 min)→取沉淀冷凍干燥→巖豆鹽溶蛋白。

1.2.2 巖豆水溶蛋白的提取工藝

巖豆→去皮→粉碎→石油醚脫脂10 h→加入超純水(料液比1∶50)→磁力攪拌40 min(恒溫50℃)→離心(8 000 r/min, 15 min)→取上清液→調節(jié)pH至4.5→離心(8 000 r/min，15 min)→取沉淀冷凍干燥→巖豆水溶蛋白。

1.2.3 巖豆鹽溶蛋白的酶解

酶液的配制：酶試劑→加入相應pH的緩沖液(濃度為20 U/mL)→預熱15 min→酶液。

酶解：巖豆鹽溶蛋白 → 加超純水溶解 → 加入酶液進行酶解 →每隔30 min 振蕩搖勻1次→一定時間后沸水浴處理10 min滅酶→7 000 r/min離心10 min→上清液→酶解液。

同時設置1組空白對照組(不加酶)。

1.2.4 蛋白酶的篩選

以胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶為篩選對象，選擇底物質量濃度0.8 mg/mL、酶添加量1 500 U/g，酶解溫度和pH 在各自最適條件(表1)下進行酶解反應，并分別在5、15、30、60、120、180、240、300、360 min 時取樣測定DPPH自由基清除率，以DPPH自由基清除率為指標，篩選出酶解最優(yōu)酶。

表1 蛋白酶酶解條件

1.2.5 DPPH自由基清除率的測定

參照Xie等[10]的方法略有改進。將DPPH溶于95%乙醇中配制成濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液。取2 mL酶解液和2 mL的DPPH溶液進行混合，搖勻后放置室溫下30 min，在517 nm處測定吸光值(A樣品)，空白組以等體積95%乙醇溶液替換DPPH，在517 nm處測定其吸光值(A空白)，對照組以等體積相應pH的緩沖液代替樣品溶液，在517 nm測定吸光值(A對照)，按下式計算DPPH自由基清除率。

1.2.6 多肽得率的測定

多肽得率=N1/N2×100%

式中：N1為多肽含量;N2為底物總蛋白含量。

2 結果與分析

2.1 酶解底物的選擇

分別采用1.2.1、1.2.2制備巖豆鹽溶蛋白與水溶蛋白，對其DPPH自由基清除能力及蛋白提取率進行比較，結果見圖1。

由圖1可知，巖豆水溶蛋白的提取率(21.32%)高于鹽溶蛋白(11.79%)，但是用超純水配制成相同濃度的蛋白液后(未添加酶液)，鹽溶蛋白的DPPH 自由基清除率(24.01%)高于水溶蛋白(18.22%)，且差異顯著。故選取巖豆鹽溶蛋白為后續(xù)試驗原料。

注: 不同大小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

圖1 巖豆水溶蛋白與鹽溶蛋白DPPH自由基清除能力及蛋白提取率的比較

2.2 蛋白酶的篩選

按照1.2.4的方法采用4種蛋白酶進行巖豆鹽溶蛋白的酶解，隨著酶解時間的延長，4種蛋白酶處理后所得酶解液的DPPH自由基清除能力比較如圖2所示。

圖2 4種蛋白酶處理后酶解液的DPPH自由基清除能力比較

由圖2可知，巖豆鹽溶蛋白在經(jīng)過4種蛋白酶處理后，DPPH自由基清除率大體上均呈現(xiàn)出先上升后下降最后趨于穩(wěn)定的趨勢，說明延長酶解時間對酶解產(chǎn)物提高DPPH自由基清除能力效果不顯著。利用胃蛋白酶酶解巖豆鹽溶蛋白得到的酶解液對DPPH自由基具有較高清除能力，在30 min時達到69.84%。經(jīng)菠蘿蛋白酶和中性蛋白酶處理120 min后，酶解液的DPPH自由基清除率分別達到44.23%和45.70%。胃蛋白酶9個時間點的DPPH自由基清除率均顯著高于其他3種酶處理?？赡苁且驗槲傅鞍酌冈趯r豆鹽溶蛋白進行剪切時，能夠識別具有一定特異性的氨基酸序列[12]，酶解后得到具有較強抗氧化能力的小肽。同時，酶解液的DPPH自由基清除率均高于未加酶的空白組(24.01%)，說明酶解法確實有利于抗氧化肽的制備。因此，選擇胃蛋白酶為酶解優(yōu)化的酶制劑。

（4）盡量采用自繁自養(yǎng)的養(yǎng)殖模式，嚴禁從疫區(qū)引進種豬、副產(chǎn)品以及設備設施。如果不確定為疫區(qū)或非疫區(qū)，要對設備設施進行徹底消毒，對引進的種豬進行嚴格的檢疫，確認無病后才可以混群飼養(yǎng)[5]。

2.3 單因素試驗

2.3.1 酶解時間對酶解效果的影響

固定酶解pH 2.0、酶添加量1 500 U/g(以底物質量計，下同)、底物質量濃度0.8 mg/mL、酶解溫度35℃條件下，考察酶解時間對酶解效果的影響，結果見圖3。

圖3 酶解時間對酶解效果的影響

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，DPPH自由基清除率逐漸增大，在30 min達到最高值(59.41%)，繼續(xù)延長酶解時間，DPPH自由基清除率出現(xiàn)下降趨勢。可能是隨著酶解時間的延長，原本具有較高活性的肽被酶解成活性較低的小肽或氨基酸[13]，使得抗氧化肽活性下降，之后溶液中多肽和氨基酸的濃度達到飽和，酶解反應停止，抗氧化活性逐漸趨于穩(wěn)定。因此，選取30 min為最適酶解時間。

2.3.2 酶解溫度對酶解效果的影響

固定酶解pH 2.0、酶添加量1 500 U/g、底物質量濃度0.8 mg/mL、酶解時間30 min條件下，考察酶解溫度對酶解效果的影響，結果見圖4。

圖4 酶解溫度對酶解效果的影響

由圖4可知，當酶解溫度由25℃升高至35℃時，巖豆鹽溶蛋白酶解液的DPPH自由基清除率顯著增加，繼續(xù)升高酶解溫度，DPPH自由基清除率顯著下降。可能是由于溫度的升高，使得胃蛋白酶的結構發(fā)生了一定的改變，從而影響了酶解效果，也可能是由于溫度的升高改變了巖豆抗氧化肽的結構，使其活性下降。當酶解溫度為35℃時，DPPH 自由基清除率達到最大值(62.67%)。因此，選擇35℃為最適酶解溫度。

2.3.3 酶添加量對酶解效果的影響

固定酶解pH 2.0、酶解溫度35℃、底物質量濃度0.8 mg/mL、酶解時間30 min條件下，考察酶添加量對酶解效果的影響，結果見圖5。

由圖5可知，隨酶添加量的增大，DPPH自由基清除率呈上升趨勢，在酶添加量達到1 500 U/g時，DPPH自由基清除率達到最大值(64.91%)。當酶添加量超過1 500 U/g后，DPPH 自由基清除率下降，隨后趨于穩(wěn)定，可能是因為胃蛋白酶的有效成分與底物蛋白的特異性結合位點達到飽和[14]，酶解效率變化不顯著，同時由于過多的胃蛋白酶參與酶解，使得抗氧化活性較強的肽段被酶解為活性較弱的小肽，造成了DPPH自由基清除率的下降。因此，選取1 500 U/g為最適酶添加量。

圖5 酶添加量對酶解效果的影響

2.3.4 底物質量濃度對酶解效果的影響

固定酶解pH 2.0、酶添加量1 500 U/g、酶解溫度35℃、酶解時間30 min條件下，考察底物質量濃度對酶解效果的影響，結果見圖6。

圖6 底物質量濃度對酶解效果的影響

由圖6可知，DPPH自由基清除率隨底物質量濃度的增大而增大，在底物質量濃度為1.2 mg/mL時取得最大值(81.24%)，但是在后續(xù)試驗中發(fā)現(xiàn)在底物質量濃度大于0.8 mg/mL時改變酶添加量，對DPPH自由基清除率的影響不顯著，無法確定最適酶添加量。并且在底物質量濃度大于1.2 mg/mL時，DPPH溶液與酶解液混合后溶液變得渾濁，影響吸光值的測定?？赡苁怯捎诿附獾孜餄舛冗^高，造成酶解液中含有的有效抗氧化活性成分達到飽和析出[15]，從而使DPPH自由基清除率雖然有提升但是對酶添加量的變化不敏感。因此，選擇0.8 mg/mL為最適底物質量濃度。

2.4 響應面試驗

2.4.1 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗結果的基礎上，固定底物質量濃度0.8 mg/mL、酶解pH 2.0,采用Design Expert 8.0.6軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，以酶解溫度(A)、酶添加量(B)、酶解時間(C)為考察因素，以DPPH自由基清除率(Y)為響應值，設計三因素三水平的響應面試驗，進行二次多元回歸方程擬合及其優(yōu)化分析。響應面試驗因素水平見表2，響應面試驗設計及結果見表3。

表2 響應面試驗因素水平

表3 響應面試驗設計及結果

利用Design Expert 8.0.6軟件對表3數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，響應值與各因素之間的二次多元回歸方程式如下：

Y=69.63-2.10A+5.27B+0.055C-0.93AB+1.20AC+2.21BC-11.30A2-13.79B2-11.43C2

對該模型進行方差分析，結果如表4所示。

表4 回歸方程方差分析

注:**表示差異極顯著(P<0.01); *表示差異顯著(P<0.05)。

2.4.2 模型驗證試驗

通過Design Expert軟件，以最大DPPH自由基清除率為指標分析響應面試驗結果，獲得酶解巖豆鹽溶蛋白制備抗氧化肽的最優(yōu)酶解條件為酶解溫度34.07℃、酶添加量1 098.14 U/g、酶解時間35.43 min，此時DPPH自由基清除率為70.25%。為方便驗證同時結合實際情況，將參數(shù)修正為酶解溫度34℃、酶添加量1 100 U/g、酶解時間36 min。在最優(yōu)條件下做3次平行試驗，測得此條件下DPPH自由基清除率為70.41%，接近于理論值，表明該模型可較好地預測各因素與響應值之間的影響關系，并測得該條件下多肽得率為53.63%。

3 結 論

以巖豆鹽溶蛋白為原料，DPPH自由基清除率為評價指標，利用單因素試驗和響應面優(yōu)化胃蛋白酶酶解巖豆鹽溶蛋白制備抗氧化肽的工藝，得到最優(yōu)酶解條件為酶解溫度34℃、酶添加量1 100 U/g、酶解時間36 min、酶解pH 2.0、底物質量濃度0.8 mg/mL，此條件下DPPH自由基清除率為70.41%、多肽得率為53.63%。本研究表明巖豆鹽溶蛋白酶解液具有一定的抗氧化活性，可以利用巖豆鹽溶蛋白制備抗氧化肽。本研究為增加巖豆的附加值提供一種思路，并為分離純化巖豆抗氧化肽，研究其抗氧化機理奠定了基礎。