針灸對(duì)CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期的影響*

劉海偉，路 玫

(1.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008)

烷化劑環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)是臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤化療藥物和免疫抑制藥物,使用后的反復(fù)毒性作用可造成骨髓造血微環(huán)境的損害[1]，并呈現(xiàn)不可逆的改變。骨髓造血微環(huán)境是造血干細(xì)胞賴以增殖、分化、成熟的“土壤”。造血微環(huán)境主要由基質(zhì)細(xì)胞(stromal cells)、細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)和造血生長(zhǎng)因子(hematopoietic growth factor)組成。其中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(Bone marrow stromal cell，BMSC)是造血微環(huán)境的重要組成成分。通過產(chǎn)生并分泌細(xì)胞黏附分子及造血因子，調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的歸巢、定位、增殖、分化、成熟、遷移、凋亡[2]。化療后造血微環(huán)境的損傷主要表現(xiàn)在骨髓基質(zhì)細(xì)胞多種粘附分子表達(dá)降低和粘附能力下降，嚴(yán)重影響著造血細(xì)胞的分裂增殖。本課題組前期研究證實(shí)，針灸可以促進(jìn)化療后骨髓細(xì)胞的抗損傷和修復(fù)功能，加速骨髓細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)細(xì)胞DNA的合成，保護(hù)骨髓細(xì)胞，使CTX的骨髓抑制狀態(tài)得到改善[3]。本實(shí)驗(yàn)研究利用CTX建立小鼠骨髓抑制模型，通過觀察針灸對(duì)CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)細(xì)胞周期變化的影響，探討針灸對(duì)抗化療毒副反應(yīng)、改善骨髓造血微環(huán)境中BMSC細(xì)胞周期變化、促進(jìn)造血功能重建的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選用SPF級(jí)雄性昆明種小鼠40只,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證號(hào):scxk(豫)2014-0001,體質(zhì)量(22±2)g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)回后,在相對(duì)濕度60%、溫度20～25℃的清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室中，自由喂養(yǎng)3 d，小鼠稱重后，依據(jù)體質(zhì)量按照隨機(jī)分層分組的方法，分籠飼養(yǎng)，每籠5只。分別為空白組、模型組、針刺組、艾灸組，每組10只。用苦味酸溶液對(duì)各組小鼠進(jìn)行染色編號(hào)。

1.2 主要試劑

環(huán)磷酰胺(0.12 g/瓶,山西普德藥業(yè)有限公司，批號(hào):20070303)；4%多聚甲醛固定液(上海歌凡生物有限公司，批號(hào)：20140204)；10%EDTA脫鈣液(青島捷世康生物科技有限公司，批號(hào)：20140713)；凱基細(xì)胞DNA含量檢測(cè)試劑盒(細(xì)胞周期，南京生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)：KGA511-KGA512);HRP辣根過氧化物酶,中性樹膠封片劑；PBS緩沖液；70%乙醇。

1.3 儀器及材料

低速離心機(jī)(江蘇太倉(cāng)醫(yī)療器械廠);COULTER EPICS-XL型流式細(xì)胞儀(美國(guó)Coulter公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)SHELLAB公司);-80℃低溫冰箱(河南新鄉(xiāng)新飛公司);生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司);薄片離心機(jī)SHANDON(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(江蘇醫(yī)療器械廠);pH儀(PHS-25型，上海醫(yī)療器械廠);8112型磁力恒溫?cái)嚢杵?上?？h曹行無線電廠);電熱干燥箱;孵育盒;MicromHM 340E石蠟切片機(jī);37℃恒溫水箱;200目篩網(wǎng);細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。

1.4 造模方法

依據(jù)《新藥(西藥)臨床研究指導(dǎo)原則匯編》[4]的模型制作方法，模型組、針刺組、艾灸組分別采用環(huán)磷酰胺(CTX)建立骨髓抑制小鼠模型。腹腔注射CTX100 mg/kg/d(按照小鼠體質(zhì)量0.02 mL/g用藥量，注射濃度為5 mg/mL的CTX溶液)，后分別在24 h、48 h再行CTX注射，即連續(xù)3 d。停藥后4 h模型制作成功(依據(jù)環(huán)磷酰胺藥代動(dòng)力學(xué)過程，4 h后藥物活性消失[5])?？瞻捉M給予注射同等劑量的生理鹽水，連續(xù)3 d。

1.5 固定小鼠

右手食指、拇指捏住小鼠尾巴，將小鼠置于鼠籠蓋上，小鼠向前爬時(shí)，用左手大拇指和食指內(nèi)側(cè)面捏住小鼠頭頸部皮膚以固定小鼠，用無名指和小指配合大魚際共同固定小鼠尾骶部及尾巴，然后用力量大小適宜的塑料夾子(布條纏繞其夾口，以防止對(duì)小鼠四肢造成損傷)，夾住小鼠四肢后，將小鼠俯臥位固定于預(yù)先備好的鼠板上。

1.6 干預(yù)方法

選取“大椎”“膈俞”“腎俞”“足三里”。小鼠穴位定位依據(jù)《中國(guó)獸醫(yī)針灸學(xué)》[6]，并模擬大鼠定位方法，具體定位為“大椎”位于背中線上，第7頸椎與第1胸椎棘突間；“膈俞”位于第7胸椎棘突下，左右各1穴；“腎俞”在第2腰椎棘突下，左右各1穴；“足三里”位于小鼠后肢膝關(guān)節(jié)下外側(cè)，腓骨小頭下3.5 mm處取穴，左右各1穴。

1.6.1 針刺組 采用華佗牌美容毫針(規(guī)格:0.19 mm×10.00 mm,由蘇州醫(yī)療器械用品有限公司制作),采用快速進(jìn)針法直刺,進(jìn)針深度為3 mm,行捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法1次,留針6 min。每天1次,連續(xù)5 d。

1.6.2 艾灸組 用特制美容細(xì)艾條(規(guī)格:0.4 cm×25 cm,由河南南陽臥龍艾絨廠制作)點(diǎn)燃后,在距離穴位皮膚5 mm處每穴固定懸灸3 min。每天1次,連續(xù)5 d。

1.6.3 空白組、模型組 每天陪同針刺組、艾灸組抓取、固定,不做任何治療。

1.7 觀察指標(biāo)及方法

依次從治療后第1天、第3天、第5天，觀察各組小鼠骨髓造血微環(huán)境中BMSC細(xì)胞周期百分率的變化。

1.7.1 小鼠骨髓石蠟包埋塊制作 將預(yù)先用4%多聚甲醛固定好的左側(cè)小鼠股骨，采用10%EDTA脫鈣液脫鈣1周，脫鈣成功后，依次采用全自動(dòng)脫水機(jī)按如下步驟和時(shí)間進(jìn)行脫水：70%乙醇2 h；80%乙醇2 h；90%乙醇2 h；95%乙醇Ⅰ2 h；95%乙醇Ⅱ 2 h；無水乙醇Ⅰ 1 h；無水乙醇Ⅱ 1 h。然后分別二甲苯Ⅰ 30 min；二甲苯Ⅱ 30 min進(jìn)行透明。經(jīng)過透明處理后，應(yīng)用石蠟Ⅰ(50～52℃)60 min；石蠟Ⅱ(60～62℃)60 min浸蠟處理。經(jīng)過浸蠟后應(yīng)用全自動(dòng)包埋儀進(jìn)行蠟塊包埋。包埋好的蠟塊置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2 石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液制備 具體制備步驟為：切片機(jī)上切取整塊石蠟包埋組織塊，將其切為3～5片，厚度為40～50 μm，而后全部置于試管中；在室溫下加入二甲苯5 mL脫蠟，依據(jù)脫蠟程度，可置換1次二甲苯，待石蠟脫凈后，棄除二甲苯；依次分別加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5 mL進(jìn)行水化，每步10 min，后棄乙醇，加入蒸餾水5 mL，5 min后棄去；后加入0.5%胃蛋白酶消化液5 mL，置于37℃恒溫水箱中消化30 min，期間每隔10 min震蕩1次；消化30 min，加入生理鹽水終止消化；采用300目尼龍網(wǎng)過濾，消化未徹底的可進(jìn)行2次消化；收集細(xì)胞懸液，依據(jù)1 500 r/min離心沉淀，后經(jīng)生理鹽水漂洗2次，500～800 r/min離心沉淀，去除參與碎片，制備好的細(xì)胞懸液，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板技術(shù)，制作成1×106/mL的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)單細(xì)胞懸液，置于4℃冰箱保存待測(cè)。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

應(yīng)用凱基細(xì)胞周期DNA含量檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供，產(chǎn)品批號(hào)：KGA511-KGA512)，具體操作步驟為：將用PBS洗滌過的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC),采用2 000 r/min轉(zhuǎn)速,離心5 min制備單細(xì)胞懸液，其細(xì)胞濃度為1×106/mL，取1 mL單細(xì)胞懸液；將制備的單細(xì)胞懸液離心后，去除上清，在細(xì)胞中加入體積分?jǐn)?shù)為70%冷乙醇500 μL固定2 h，4℃保存，后用PBS洗去固定液；加入100 μL RNaseA37℃水浴30 min；再加入400 μL PI染液染色混勻，4℃避光30 min；上機(jī)檢測(cè)，每份標(biāo)本重復(fù)檢測(cè)3次，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光。用DNA MultiCycle軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)G1期細(xì)胞百分率比較

表1 各組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)G1期細(xì)胞百分率比較

注：與空白組比較，1)P<0.05，4)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05，5)P<0.01；與針刺組比較，3)P<0.05。

如表1所示，模型組、針刺組、艾灸組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中BMSC的G1期細(xì)胞百分率變化趨勢(shì)大致相同。與空白組比較，模型組中的3 d組與5 d組BMSC的G1期細(xì)胞百分率明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,或P<0.01)，見圖1；針刺組中1 d組BMSC的G1期細(xì)胞百分率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，針刺組中的3 d組與5 d組BMSC的G1期細(xì)胞百分率明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；與針刺組比較，艾灸組中的5 d組BMSC的G1期細(xì)胞百分率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 空白組骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)分析圖

2.2 各組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)S期細(xì)胞百分率比較

表2 各組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)S期細(xì)胞百分率比較

注：與空白組比較，1)P<0.05，4)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05；與針刺組比較，3)P<0.05。

如表2所示，與空白組比較，模型組中的1 d組與3 d組、5 d組BMSC的S期細(xì)胞百分率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，針刺組3 d組BMSC的S期細(xì)胞百分率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2；與針刺組比較，艾灸組5 d組BMSC的S期細(xì)胞百分率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 模型組骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)分析圖

2.3 各組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)G2期細(xì)胞百分率比較

表3 各組CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)G2期細(xì)胞百分率比較

注：與空白組比較，1)P<0.05，4)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05,5)P<0.01；與針刺組比較，3)P<0.05。

如表3所示，與空白組比較，模型組中的1 d組、3 d組與5 d組BMSC的G2期細(xì)胞百分率明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，針刺組3 d組BMSC的G2期細(xì)胞百分率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與針刺組比較，艾灸組3 d組BMSC的G2期細(xì)胞百分率明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3～4。

圖3 針刺組骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)分析圖

圖4 艾灸組骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)分析圖

3 討論

骨髓造血微環(huán)境又稱龕，可調(diào)節(jié)、定位造血干細(xì)胞[7]，是造血干細(xì)胞(HSCs)的特化結(jié)構(gòu)，其可駐留并調(diào)控HSCs，使之歸巢，造血微環(huán)境主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)及非細(xì)胞成分組成，骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)為其核心組成部分[8]?；熀罂梢砸鸸撬柙煅h(huán)境的嚴(yán)重破壞，同時(shí)也可以導(dǎo)致骨髓基質(zhì)細(xì)胞受損[9]，出現(xiàn)骨髓造血功能障礙。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)周期變化是反應(yīng)骨髓造血微環(huán)境造血功能的主要指標(biāo)之一。細(xì)胞周期分為分裂間期和分裂期(M期)，分裂間期分為G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)[10]。有研究證實(shí)，骨髓細(xì)胞無法進(jìn)行正常有絲分裂，從而產(chǎn)生骨髓抑制[10]。

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)并無“骨髓抑制”病名，依據(jù)該病的病因病機(jī)及臨床癥狀，可歸屬于中醫(yī)內(nèi)科學(xué)中“虛勞”范疇，病因多由機(jī)體正氣不足、復(fù)感外來化療之毒邪，導(dǎo)致氣血生化之源匱乏、肝腎精血不足，導(dǎo)致“毒邪”與氣血相互搏擊，使氣血臟腑功能失調(diào)，發(fā)為本病。病機(jī)主要責(zé)之于氣血雙虧、腎精不足。依據(jù)“勞則溫之”“虛則補(bǔ)之”的治則，采用針刺和艾灸大椎、膈俞、腎俞、足三里，以達(dá)益氣健脾、調(diào)補(bǔ)氣血和培補(bǔ)后天之功。

本研究結(jié)果顯示，針灸可以減少CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)G1期細(xì)胞百分率，從而加速BMSC向S期的轉(zhuǎn)化。在針刺和艾灸治療3 d后，CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)S期細(xì)胞百分率均明顯升高，且高于空白組和模型組的水平，說明針刺和艾灸可以使CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)S期細(xì)胞百分率升高，S期為細(xì)胞DNA合成期，同時(shí)也佐證了采用針灸治療3 d后，對(duì)骨髓造血微環(huán)境中BMSC的DNA有修復(fù)和保護(hù)作用。但在采用針刺和艾灸治療5 d后，CTX化療小鼠骨髓造血微環(huán)境中骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)S期細(xì)胞百分率呈下降趨勢(shì)，說明隨著治療時(shí)間的累積，針灸有減少骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)S期細(xì)胞百分率的作用，可加速骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)向G2期轉(zhuǎn)化。針灸可促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)G2期細(xì)胞百分率升高，

G2期為BMSC的DNA合成后期，說明針灸可促進(jìn)CTX化療后BMSC損傷后的自身修復(fù)，加速BMSC的有絲分裂和增殖。同時(shí)可以使經(jīng)CTX化療受損的BMSC分裂停滯狀態(tài)得到修復(fù)。

烷化劑環(huán)磷酰胺(CTX)致骨髓造血微環(huán)境損傷后，干擾了骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)的細(xì)胞周期規(guī)律，使BMSC的DNA含量減少，使BMSC的細(xì)胞分裂停滯，從而產(chǎn)生骨髓抑制，導(dǎo)致骨髓造血功能障礙。采用本課題研究組抗化療穴組“大椎”“膈俞”“腎俞”“足三里”[11-12]，可以使經(jīng)環(huán)磷酰胺(CTX)化療后骨髓造血微環(huán)境中的骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSC)受損的細(xì)胞周期得到恢復(fù)，可加速BMSC中G1期向S期、S期向G2期的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)BMSC的受損DNA在S期大量合成、修復(fù)，并可延長(zhǎng)BMSC中G2期，使BMSC完成分裂與增殖，提高骨髓造血微環(huán)境中BMSC的修復(fù)能力，保護(hù)骨髓造血微環(huán)境,促進(jìn)骨髓造血功能的重建。