七葉皂苷鈉抑制大鼠晶狀體組織氧化損傷的實驗研究

李雅琢，徐甄，蘭天野，張議文，張麗娟，劉平

七葉皂苷鈉(sodium aescinate)因其具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎、改善微循環(huán)作用而用于各種腦缺血性疾病的治療[1]。然而，國內(nèi)外關(guān)于七葉皂苷鈉對大鼠晶狀體保護(hù)作用的研究卻很少，但是有研究發(fā)現(xiàn)七葉皂苷鈉高劑量處理組可以抑制晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB 的活化表達(dá)，抑制通過紫外線照射方法誘導(dǎo)離體大鼠晶狀體發(fā)生白內(nèi)障[2]。本研究將七葉皂苷鈉作用于氧化損傷誘導(dǎo)的白內(nèi)障大鼠晶狀體，觀察該藥物對晶狀體組織透明度、晶狀體上皮細(xì)胞形態(tài)、晶狀體組織內(nèi)還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、過氧化氫酶（catalase，CAT）活力及NF-κB 蛋白表達(dá)的影響，以期為臨床白內(nèi)治療障提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

七葉皂苷鈉 (購于武漢普生制藥有限公司)，NF-κB 抗體(上海碧云天公司)，還原性谷胱甘肽（GSH）及過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物工司），蘇木素-伊紅染色劑(武漢博士德生物工程有限公司)，手術(shù)顯微鏡(德國Leica)，BCA 蛋白測定試劑盒、PVDF 膜及化學(xué)發(fā)光試劑(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 晶狀體分離及培養(yǎng) 清潔級健康雄性4 周齡Sprague-Dawley 大 鼠40 只，體質(zhì)量(160±20) g，購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實驗動物研究中心。脫臼后，在解剖顯微鏡下無菌操作取兩只眼睛，用生理鹽水、青霉素(80 萬U/500 mL)和慶大霉素(8 萬U/500 mL)沖洗3 次后，在顯微鏡下分離晶狀體組織，置入含有1.5 mL M199 的24 孔培養(yǎng)板中，每孔1 只晶狀體。

1.2.2 實驗分組 按照隨機(jī)數(shù)字法將晶狀體分為4組，每組20 只晶狀體?？瞻讓φ战M：單純M199 培養(yǎng)基培養(yǎng)；七葉皂苷鈉組：M199 培養(yǎng)基內(nèi)七葉皂苷鈉濃度為0.2 g/L；氧化損傷組：培養(yǎng)基內(nèi)H2O2濃度為1 mmol/L；氧化損傷+七葉皂苷鈉組：培養(yǎng)基內(nèi)H2O2濃度為1 mmol/L，七葉皂苷鈉濃度為0.2 g/L，分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h 后取相應(yīng)時間點晶狀體觀察并實驗。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 晶狀體透明度觀察記錄方法 取上述各時間點的各組晶狀體觀察透明度。在白色背景下設(shè)計粗細(xì)一致的十字交叉黑色線條，將被檢晶狀體置于十字交叉處，以透過晶狀體所能看到的清晰度予以分級?！?”：晶狀體透明，線條清晰可見；“+”：線條增粗，模糊，但是完全可見；“++”：僅晶狀體中央部隱約可見線條輪廓；對“+”的數(shù)量行統(tǒng)計學(xué)處理。

1.3.2 HE 染色 晶狀體觀察透明度后，每組隨機(jī)取10 只晶狀體迅速浸入新鮮配制的多聚甲醛（40 g/L）中固定40 min，制備石蠟切片，用蘇木素染色5 min，蒸餾水洗滌，去玻片的浮色，置于1%鹽酸乙醇中浸泡10 s 后伊紅染色5 min，再用蒸餾水洗滌以除去浮色。

1.3.3 透射電鏡2.5%戊二醛溶液固定晶狀體24 h，醋酸鈾染液染色，丙酮脫水，常規(guī)電鏡包埋，制作超薄切片，枸櫞酸鉛和2%醋酸雙氧鈾染色，透射電鏡觀察（×10000）。

1.3.4 GSH 含量及CAT 活力測定 取適量晶狀體組織制成勻漿，3000 r/min 離心15 min，去上清液置于EP 管內(nèi)，按照試劑盒說明，采用ELISA 法測定GSH含量及CAT 活力。

1.3.5 Western blot 檢測 將每組剩余的10 只晶狀體以RIPA 裂解液提取總蛋白后，用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒測定濃度，電泳分離蛋白及轉(zhuǎn)膜后分別加入一抗、二抗，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法曝光顯影并掃描灰度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組晶狀體透明度情況

空白對照組及七葉皂苷鈉組透過晶狀體可以清晰看到下方的十字線，氧化損傷組晶狀體透明度明顯下降，晶狀體下方的十字線變得模糊。與空白對照組比較，氧化損傷組在6 h（χ2=4.970，P=0.043），12 h（χ2=7.619，P=0.006）及24 h（χ2=5.714，P=0.017）時間點上均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與七葉皂苷鈉組比較，氧化損傷組在6 h（χ2=4.803，P=0.028），12 h（χ2=6.144，P=0.013）及24 h（χ2=4.444，P=0.035）時間點上也均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而氧化損傷+七葉皂苷鈉組晶狀體混濁情況明顯輕于氧化損傷組，與氧化損傷組比較，12 h （χ2=4.800，P=0.028） 及24 h（χ2=4.444，P=0.035）時間點上差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1，表1）。

表1 各組晶狀體混濁數(shù)量比較（n=20）

2.2 HE 染色情況

空白對照組及七葉皂苷鈉組晶狀體上皮細(xì)胞為單層立方形細(xì)胞，排列整齊。而氧化損傷組晶狀體邊緣不規(guī)則，晶狀體上皮細(xì)胞大小不一，細(xì)胞排列紊亂，近赤道部尤其明顯，給予七葉皂苷鈉干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)逐漸規(guī)則（圖2）。

2.3 電鏡觀察大鼠晶狀體

透射電鏡觀察顯示，空白對照組及七葉皂苷鈉組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核膜連續(xù)，染色質(zhì)均勻，核仁結(jié)構(gòu)清晰；氧化損傷組晶狀體上皮細(xì)胞基質(zhì)密度減低，胞質(zhì)內(nèi)空泡形成，細(xì)胞核腫脹，染色質(zhì)稀疏；給予七葉皂苷鈉干預(yù)后，細(xì)胞形態(tài)逐漸改善，細(xì)胞內(nèi)仍可見線粒體空泡樣改變，細(xì)胞核形態(tài)略規(guī)整（圖3）。

圖1 各組晶狀體透明度觀察。1A 空白對照組；1B 七葉皂苷鈉組；1C 氧化損傷組；1D 氧化損傷+七葉皂苷鈉組

圖2 HE 染色觀察近赤道部大鼠晶狀體前膜囊及晶狀體上皮細(xì)胞(×40)。2A 空白對照組；2B 七葉皂苷鈉組；2C 氧化損傷組；2D 氧化損傷+七葉皂苷鈉組

圖3 透射電鏡觀察大鼠晶狀體（×10000）。3A 空白對照組；3B 七葉皂苷鈉組；3C 氧化損傷組；3D 氧化損傷+七葉皂苷鈉組?！骱四ぃ? 染色質(zhì)；# 空泡

2.4 晶狀體組織中GSH 含量及CAT 活力變化

GSH 含量：氧化損傷組與空白對照組比較，t=12.024，P=0.000；與七葉皂苷鈉組比較，t=15.240，P=0.000；與氧化損傷+七葉皂苷鈉組比較，t=5.573，P=0.005，均有統(tǒng)計學(xué)意義。

CAT 活力：氧化損傷組與空白對照組比較，t=9.461，P=0.000；與七葉皂苷鈉組比較，t=9.482，P=0.000；與氧化損傷+七葉皂苷鈉組比較，t=4.118，P=0.015，均有統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2 晶狀體組織GSH 含量、CAT 活力及NF-κB 蛋白相對表達(dá)量變化

2.5 Western-blot 檢測晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB 表達(dá)的影響

氧化損傷組大鼠晶狀體中NF-κB 的蛋白表達(dá)量顯著高于空白對照組及七葉皂苷鈉組（t空白=5.175，P空白=0.007；t七葉皂苷=3.924，P七葉皂苷=0.017）；氧化損傷+七葉皂苷鈉組大鼠晶狀體中NF-κB 的蛋白表達(dá)量降低，與氧化損傷組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.571，P=0.023）（表2，圖4）。

3 討論

圖4 Western-blot 檢測晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB 蛋白表達(dá)。NFκB：核因子κB；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶

氧化應(yīng)激參與人體許多衰老疾病的發(fā)生，如阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、帕金森病等，另外，許多視力損害和致盲疾病也與氧化應(yīng)激有關(guān)，如青光眼、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜病變等[3-4]。其中，白內(nèi)障的發(fā)生率在致盲性眼病中最高，有效的防治藥物仍然是最理想的治療選擇。國內(nèi)外已有許多實驗和流行病學(xué)研究建議可以通過使用抗氧化劑和某些代謝受體激動劑延緩白內(nèi)障的發(fā)生[5-6]。

七葉皂苷鈉主要成分為三萜皂苷，臨床上多用于缺血性腦病及腦水腫的治療[7-8]。近年來，逐漸有學(xué)者將七葉皂苷鈉引入到眼科疾病的治療中[9-10]。本課題旨在探討七葉皂苷鈉在氧自由基導(dǎo)致的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡中的作用，從而進(jìn)一步拓寬七葉皂苷鈉的臨床應(yīng)用。

為了研究白內(nèi)障病變的發(fā)生機(jī)理并探索出更多的治療性藥物，國內(nèi)外學(xué)者嘗試了大量方法誘導(dǎo)晶狀體組織凋亡，例如：化學(xué)藥物、紫外線照射、H2O2等[11-12]。本實驗中，我們參考既往學(xué)者制備過氧化氫誘導(dǎo)鼠白內(nèi)障方法，建立大鼠白內(nèi)障模型，觀查七葉皂苷鈉對晶狀體上皮細(xì)胞的保護(hù)作用[2，13]。晶狀體形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，氧化損傷組晶狀體透明度明顯下降，七葉皂苷鈉作用后，晶狀體透明度提高，表明七葉皂苷鈉的干預(yù)對維持晶狀體透明度有保護(hù)作用。此外，HE 染色顯示氧化損傷組晶狀體囊皺縮，晶狀體上皮細(xì)胞紊亂，這可能是由于H2O2刺激后影響了晶狀體內(nèi)離子通道的正常功能，晶狀體的代謝及防御功能出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致晶狀體前囊膜受損，從而誘導(dǎo)了晶狀體的混濁。

晶狀體組織氧化損傷后會產(chǎn)生一系列的病理改變，產(chǎn)生大量自由基，自由基通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引發(fā)脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，從而導(dǎo)致GSH 及CAT 等抗氧化酶清除自由基的能力降低，導(dǎo)致晶狀體混濁進(jìn)一步加重。本研究結(jié)果顯示，氧化損傷組GSH 含量和CAT 活力明顯低于空白對照組及七葉皂苷鈉組，說明氧化損傷組晶狀體組織氧化損傷程度較重，七葉皂苷鈉處理后GSH 含量和CAT 活力均升高，表明七葉皂苷鈉具有抑制脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)的能力，進(jìn)一步抑制了晶狀體損傷的發(fā)生。

NF-κB 屬腫瘤壞死因子受體超家族的一員，參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答反應(yīng)，可以對有害細(xì)胞的刺激做出反應(yīng)，許多分子都受NF-κB 的調(diào)控[14]。我們的研究結(jié)果顯示，高濃度H2O2誘導(dǎo)了晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)NF-κB 水平升高，七葉皂苷鈉有效降低NF-κB 表達(dá)水平，進(jìn)一步證實七葉皂苷鈉可抑制氧化損傷誘導(dǎo)的晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。

七葉皂苷鈉的細(xì)胞毒性被公認(rèn)為低于化學(xué)合成藥物，被廣泛用于多種全身疾病的治療，鑒于其臨床應(yīng)用的有效性及安全性，我們考慮，七葉皂苷鈉有望成為治療白內(nèi)障的有效藥物，為該病的臨床治療提供新思路。